大肠杆菌氨基葡萄糖代谢途径的改造
发布时间：2021-06-08 08:50
氨基葡萄糖（Glucosamine）简称氨糖（Glc N）,广泛的存在于动物、植物以及微生物中。乙酰氨基葡萄糖（Glc NAc）作为Glc N的乙酰化产物也有着良好的生产销售市场。随着生物学的发展,Glc N的生产由传统的甲壳素水解法逐渐转变为现在比较流行的微生物发酵法,而后者主要依赖于微生物菌株代谢途径的改造。本研究首先利用双启动子载体p ETDuet-1,在E.coli BL21（DE3）菌株中异源过表达Glc N合成关键蛋白氨基葡萄糖合成酶（Glms）与乙酰氨基葡萄糖合成酶（Gna1）;其次基于Red同源重组技术,发现能够影响大肠杆菌Glc N产量的新基因yoa D与yoa E,探究新基因的缺失对于Glms酶活以及Glc N产量的影响;最后敲除了Glc N胞内转运关键基因man X,研究了碳源、温度和p H对工程菌Glc N合成的影响,具体包括以下三个方面:（1）氨基葡萄糖合成酶（Glms）与乙酰氨基葡萄糖合成酶（Gna1）是Glc N合成的关键蛋白。本研究使用p ETDuet-1质粒对glms基因（来源于菌株Bacillus subtilis168）与gna1基因（来源于菌株S...
【文章来源】：齐鲁工业大学山东省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GlcN与GlcNAc的代谢简图
齐鲁工业大学硕士学位论文7第二章Glms和Gna1的双启动子共表达研究2.1引言来自于枯草芽孢杆菌的glms基因(bsglms)与来自于酿酒酵母菌株的gna1基因(scgna1)在GlcN的代谢途径中有着关键的作用。在大肠杆菌基因组中也有着glms基因，但其受到产物GlcN的反馈抑制；本研究使用pETDuet-1作为载体对基因bsglms与scgna1进行异源表达，构建的工程菌株E.coliBL21-pETDuet-1-bsglms-scgna1较E.coliBL21菌株中Glms的酶活有所提高。双启动质粒的构建如图2.1。在第一个T7启动子后面插入bsglms基因，在第二个T7启动子后面插入scgna1基因；首先使用NcoI与HindIII酶切pETDuet-1质粒后与bsglms基因片段进行无缝克隆连接，从而构建工程质粒pETDuet-1-bsglms；随后使用NdeI与XhoI酶切pETDuet-1-bsglms质粒后与scgna1基因片段进行无缝克隆连接，构建工程质粒pETDuet-1-bsglms-scgna1。将工程质粒pETDuet-1-bsglms-scgna1转化进入E.coliBL21（DE3）感受态后构建工程菌株E.coliBL21-pETDuet-1-bsglms-scgna1。图2.1工程质粒pETDuet-1-bsglms-scgna1的构建Figure2.1ConstructionofengineeringplasmidpETDuet-1-bsglms-scgna12.2实验材料2.2.1菌株与质粒
齐鲁工业大学硕士学位论文19本论文中酶活定义为：1mL酶液1min内催化底物生成1μg谷氨酸的量作为1个氨糖合成酶活力单位。酶活计算方式为：U(μg/mL·min)=(C·V1/100)÷(T·V2/1000)，其中公式中的数字及字母代表的含义详见表2.19。表2.19酶计算公式中各参数的含义Table2.19Themeaningofeachparameterintheenzymecalculationformula参数名称含义C谷氨酸的浓度(mg/dL)V1反应总体积(120μL)V2反应酶液体积(20μL)T反应时间(min)100mg/dL转化为μg/μL的系数1000μL转化为mL的系数2.4实验结果2.4.1提取Bacillussubtilis168与SaccharomycescerevisiaeS288c基因组如图2.2所示是Bacillussubtilis168与SaccharomycescerevisiaeS288c基因组提取完成后的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1，泳道2以及泳道3为Bacillussubtilis168的基因组条带；泳道4，泳道5以及泳道6为SaccharomycescerevisiaeS288c的基因组条带。图2.2枯草芽孢杆菌与酿酒酵母的基因组电泳图Figure2.2GenomicelectrophoresisofBacillussubtilisandSaccharomycescerevisiae2.4.2提取pETDuet-1质粒提取的质粒与10×LoadingBuffer按照9:1的比例混匀后进行琼脂糖凝胶电泳。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组大肠杆菌发酵过程中乙酸的控制方法研究[J]. 吴首标. 临床医药文献电子杂志. 2019(31)
[2]温度对乙酰氨基葡萄糖发酵的影响[J]. 戴维,秦宝福,张锐,谢书琴. 山东化工. 2018(10)
[3]glmU基因单功能敲除对大肠杆菌生产氨基葡萄糖的影响[J]. 董瑞真,李丕武,石凤,李康,汪俊卿. 中国酿造. 2018(04)
[4]glmS核糖开关研究进展[J]. 周丁,王倩,祁庆生. 微生物学报. 2017(08)
[5]氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响[J]. 吴伟刚,刘威龙,诸葛福艳,田圆,刘琢冰,陈心春,周伯平. 现代肿瘤医学. 2015(05)
[6]DNS法测定D-氨基葡萄糖含量方法的研究[J]. 刘玥,刘晓兰,周利敏,郑喜群. 中国调味品. 2014(10)
[7]重组大肠杆菌发酵过程中乙酸的控制[J]. 刘兆巍,薛亚平,郑裕国. 发酵科技通讯. 2014(02)
[8]浅谈枯草杆菌的特性及其应用[J]. 周亚妮. 黔南民族医专学报. 2010(02)
[9]甲壳素/壳聚糖及其衍生物在食品工业中的应用新进展[J]. 姬小明,王建玲. 平原大学学报. 2003(04)
[10]功能性食品添加剂N-乙酰-D-葡糖胺的理化性质[J]. 赵黎明,夏文水. 无锡轻工大学学报(食品与生物技术). 2002(04)
博士论文
[1]代谢工程改造枯草芽孢杆菌高效合成N-乙酰氨基葡萄糖[D]. 刘延峰.江南大学 2015
[2]代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D]. 陈欣.江南大学 2012
硕士论文
[1]GlmS酶活力改造及对大肠杆菌产氨基葡萄糖的影响研究[D]. 温朝.齐鲁工业大学 2019
[2]Thermobaculum terrenum海藻糖合酶的耐热和催化机制分析及其催化活性定点改造的研究[D]. 任绪东.齐鲁工业大学 2019
[3]大肠杆菌代谢途径的改造对氨基葡萄糖积累的影响[D]. 董瑞真.齐鲁工业大学 2018
[4]微型近红外光谱仪用于氨基葡萄糖关键生产过程中的质量分析研究[D]. 李灿.山东大学 2017
[5]乙酰氨基葡萄糖合成关键酶GlmS和Gna1的筛选及催化动力学分析[D]. 徐小芳.江南大学 2016
[6]生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖[D]. 王雅婷.北京化工大学 2016
[7]氨基葡萄糖及其美拉德反应衍生物生理功能研究[D]. 唐杰.宁波大学 2012
本文编号：3218089
【文章来源】：齐鲁工业大学山东省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GlcN与GlcNAc的代谢简图
齐鲁工业大学硕士学位论文7第二章Glms和Gna1的双启动子共表达研究2.1引言来自于枯草芽孢杆菌的glms基因(bsglms)与来自于酿酒酵母菌株的gna1基因(scgna1)在GlcN的代谢途径中有着关键的作用。在大肠杆菌基因组中也有着glms基因，但其受到产物GlcN的反馈抑制；本研究使用pETDuet-1作为载体对基因bsglms与scgna1进行异源表达，构建的工程菌株E.coliBL21-pETDuet-1-bsglms-scgna1较E.coliBL21菌株中Glms的酶活有所提高。双启动质粒的构建如图2.1。在第一个T7启动子后面插入bsglms基因，在第二个T7启动子后面插入scgna1基因；首先使用NcoI与HindIII酶切pETDuet-1质粒后与bsglms基因片段进行无缝克隆连接，从而构建工程质粒pETDuet-1-bsglms；随后使用NdeI与XhoI酶切pETDuet-1-bsglms质粒后与scgna1基因片段进行无缝克隆连接，构建工程质粒pETDuet-1-bsglms-scgna1。将工程质粒pETDuet-1-bsglms-scgna1转化进入E.coliBL21（DE3）感受态后构建工程菌株E.coliBL21-pETDuet-1-bsglms-scgna1。图2.1工程质粒pETDuet-1-bsglms-scgna1的构建Figure2.1ConstructionofengineeringplasmidpETDuet-1-bsglms-scgna12.2实验材料2.2.1菌株与质粒
齐鲁工业大学硕士学位论文19本论文中酶活定义为：1mL酶液1min内催化底物生成1μg谷氨酸的量作为1个氨糖合成酶活力单位。酶活计算方式为：U(μg/mL·min)=(C·V1/100)÷(T·V2/1000)，其中公式中的数字及字母代表的含义详见表2.19。表2.19酶计算公式中各参数的含义Table2.19Themeaningofeachparameterintheenzymecalculationformula参数名称含义C谷氨酸的浓度(mg/dL)V1反应总体积(120μL)V2反应酶液体积(20μL)T反应时间(min)100mg/dL转化为μg/μL的系数1000μL转化为mL的系数2.4实验结果2.4.1提取Bacillussubtilis168与SaccharomycescerevisiaeS288c基因组如图2.2所示是Bacillussubtilis168与SaccharomycescerevisiaeS288c基因组提取完成后的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1，泳道2以及泳道3为Bacillussubtilis168的基因组条带；泳道4，泳道5以及泳道6为SaccharomycescerevisiaeS288c的基因组条带。图2.2枯草芽孢杆菌与酿酒酵母的基因组电泳图Figure2.2GenomicelectrophoresisofBacillussubtilisandSaccharomycescerevisiae2.4.2提取pETDuet-1质粒提取的质粒与10×LoadingBuffer按照9:1的比例混匀后进行琼脂糖凝胶电泳。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组大肠杆菌发酵过程中乙酸的控制方法研究[J]. 吴首标. 临床医药文献电子杂志. 2019(31)
[2]温度对乙酰氨基葡萄糖发酵的影响[J]. 戴维,秦宝福,张锐,谢书琴. 山东化工. 2018(10)
[3]glmU基因单功能敲除对大肠杆菌生产氨基葡萄糖的影响[J]. 董瑞真,李丕武,石凤,李康,汪俊卿. 中国酿造. 2018(04)
[4]glmS核糖开关研究进展[J]. 周丁,王倩,祁庆生. 微生物学报. 2017(08)
[5]氨基葡萄糖对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响[J]. 吴伟刚,刘威龙,诸葛福艳,田圆,刘琢冰,陈心春,周伯平. 现代肿瘤医学. 2015(05)
[6]DNS法测定D-氨基葡萄糖含量方法的研究[J]. 刘玥,刘晓兰,周利敏,郑喜群. 中国调味品. 2014(10)
[7]重组大肠杆菌发酵过程中乙酸的控制[J]. 刘兆巍,薛亚平,郑裕国. 发酵科技通讯. 2014(02)
[8]浅谈枯草杆菌的特性及其应用[J]. 周亚妮. 黔南民族医专学报. 2010(02)
[9]甲壳素/壳聚糖及其衍生物在食品工业中的应用新进展[J]. 姬小明,王建玲. 平原大学学报. 2003(04)
[10]功能性食品添加剂N-乙酰-D-葡糖胺的理化性质[J]. 赵黎明,夏文水. 无锡轻工大学学报(食品与生物技术). 2002(04)
博士论文
[1]代谢工程改造枯草芽孢杆菌高效合成N-乙酰氨基葡萄糖[D]. 刘延峰.江南大学 2015
[2]代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D]. 陈欣.江南大学 2012
硕士论文
[1]GlmS酶活力改造及对大肠杆菌产氨基葡萄糖的影响研究[D]. 温朝.齐鲁工业大学 2019
[2]Thermobaculum terrenum海藻糖合酶的耐热和催化机制分析及其催化活性定点改造的研究[D]. 任绪东.齐鲁工业大学 2019
[3]大肠杆菌代谢途径的改造对氨基葡萄糖积累的影响[D]. 董瑞真.齐鲁工业大学 2018
[4]微型近红外光谱仪用于氨基葡萄糖关键生产过程中的质量分析研究[D]. 李灿.山东大学 2017
[5]乙酰氨基葡萄糖合成关键酶GlmS和Gna1的筛选及催化动力学分析[D]. 徐小芳.江南大学 2016
[6]生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖[D]. 王雅婷.北京化工大学 2016
[7]氨基葡萄糖及其美拉德反应衍生物生理功能研究[D]. 唐杰.宁波大学 2012
本文编号：3218089
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3218089.html
最近更新
教材专著
