CRISPR辅助改造谷氨酸棒杆菌合成L-鸟氨酸
发布时间：2021-06-10 18:43
L-鸟氨酸（L-Ornithine）是尿素循环途径中的中间代谢产物,具有多种关键生理生化功能,在食品,医药和保健品领域具有广泛的市场需求。谷氨酸棒状杆菌SNK118（Corynebacterium glutamicum SNK118）是一株L-精氨酸工业生产菌株,本课题组已对其进行了全基因组重测序获得其DNA序列。本论文基于CRISPR-Cpf1系统的基因敲除和基于质粒的异源基因重组表达,对C.glutamicum SNK118进行系统工程改造用于高产L-鸟氨酸。本论文提供了一种有应用前景的高产L-鸟氨酸生产菌株和一种增强谷氨酸棒杆菌中辅因子NADPH的有效方法。（1）为切断鸟氨酸转化为瓜氨酸,并解除全局反馈阻遏调控的干扰,将SNK118基因组上的编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶的基因argF和与其相邻的编码精氨酸阻遏物的基因argR同时敲除,获得菌株KBJ01。在500-mL摇瓶发酵84 h后,KBJ01菌株的L-鸟氨酸产量为28.24 g·L?1,是对照株JML04（SNK118ΔargR）的46倍(0.62 g·L?1)。（2）为增强L-鸟氨酸...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
L-鸟氨酸生物合成途径的示意图
图 2-3 pXMJ19-CsgapC-BsrocG 质粒构2-3 Construction of pXMJ19-CsgapC-Bsroc株的构建建组质粒通过化学转化及热激操作方法1(DE3)中，构建重组大肠杆菌。菌的构建好的重组质粒采用电转方法导入到谷 验证准确后，获得多株重组菌株。瓶发酵18 系列菌株的摇瓶发酵培养条件与过：从谷氨酸棒杆菌菌株冻藏甘油管中温静置培养活化 40-48 h，挑取平板
酸棒状杆菌 SNK118 的改造敲除菌株的构建 题 研 究 采 用 CRISPR-Cpf1 基 因 编 辑 技 术 构 建 了 菌 株 C. glutaargFΔargR（KBJ01）和 KBJ01Δncgl2228（KBJ07）。建 argF 和 argR 敲除菌株 KBJ01 argF 和 argR 在谷氨酸棒状杆菌基因组上的位置相距 48 bp。参照实首先以质粒 pJYS3_ΔcrtYf 作为模板通过全质粒 PCR 反应将 crtYf 基因的 为 argF 基因的 crRNA 序列。Dpn I 消化掉 PCR 产物中的母本质粒，消主 E.coli JM109。测序验证正确后获得 pJYS3-1 质粒。然后，以 pJYS3- 扩增得到不包含 crtYf 基因上下游同源臂的 pJYS3A 片段。同时并m SNK118 基因组为模板扩增出基因 argR 的下游 D 与 argF 上游 U 同源son 组装法将这 3 个片段组装连接。构建成功获得质粒 pJYS3_ΔargFΔar-1 所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]生物酶法合成L-精氨酸衍生物的研究进展[J]. 孙安然,宋伟,刘佳,罗秋玲,陈修来,刘立明. 生物工程学报. 2018(02)
[2]加强表达3-磷酸甘油醛脱氢酶对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响[J]. 郭雯,赖联贺,张晓梅,史劲松,许正宏. 食品与发酵工业. 2016(09)
[3]微生物合成鸟氨酸的代谢工程研究进展[J]. 卢冬梅. 微生物学通报. 2015(07)
[4]谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用[J]. 还晓静,李坤,史锋,王小元. 生物工程学报. 2012(09)
[5]L-鸟氨酸高产菌的原生质体融合育种[J]. 张婧芳,汪江波,黄金明,张晶. 氨基酸和生物资源. 2009(01)
[6]L-鸟氨酸的生物功能及生产研究[J]. 汪江波,邹玉玲,薛海燕. 食品研究与开发. 2007(03)
[7]L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制[J]. 许正宏,熊筱晶,窦文芳,陶文沂. 工业微生物. 2006(04)
[8]具有广泛保健功能的L-鸟氨酸[J]. 胡学智. 食品工业. 2006(01)
[9]L-鸟氨酸快速定量检测方法[J]. 黄爱清,苏国成,王璋. 食品与发酵工业. 2005(12)
[10]L-鸟氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究[J]. 陈宁,潘韵,刘淑云,张克旭. 食品与发酵工业. 2001(01)
硕士论文
[1]辅因子代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸[D]. 占米林.江南大学 2018
[2]Gibson Assembly方法的构建及MEP途径的组合优化[D]. 刘乐山.上海医药工业研究院 2017
本文编号：3222921
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
L-鸟氨酸生物合成途径的示意图
图 2-3 pXMJ19-CsgapC-BsrocG 质粒构2-3 Construction of pXMJ19-CsgapC-Bsroc株的构建建组质粒通过化学转化及热激操作方法1(DE3)中，构建重组大肠杆菌。菌的构建好的重组质粒采用电转方法导入到谷 验证准确后，获得多株重组菌株。瓶发酵18 系列菌株的摇瓶发酵培养条件与过：从谷氨酸棒杆菌菌株冻藏甘油管中温静置培养活化 40-48 h，挑取平板
酸棒状杆菌 SNK118 的改造敲除菌株的构建 题 研 究 采 用 CRISPR-Cpf1 基 因 编 辑 技 术 构 建 了 菌 株 C. glutaargFΔargR（KBJ01）和 KBJ01Δncgl2228（KBJ07）。建 argF 和 argR 敲除菌株 KBJ01 argF 和 argR 在谷氨酸棒状杆菌基因组上的位置相距 48 bp。参照实首先以质粒 pJYS3_ΔcrtYf 作为模板通过全质粒 PCR 反应将 crtYf 基因的 为 argF 基因的 crRNA 序列。Dpn I 消化掉 PCR 产物中的母本质粒，消主 E.coli JM109。测序验证正确后获得 pJYS3-1 质粒。然后，以 pJYS3- 扩增得到不包含 crtYf 基因上下游同源臂的 pJYS3A 片段。同时并m SNK118 基因组为模板扩增出基因 argR 的下游 D 与 argF 上游 U 同源son 组装法将这 3 个片段组装连接。构建成功获得质粒 pJYS3_ΔargFΔar-1 所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]生物酶法合成L-精氨酸衍生物的研究进展[J]. 孙安然,宋伟,刘佳,罗秋玲,陈修来,刘立明. 生物工程学报. 2018(02)
[2]加强表达3-磷酸甘油醛脱氢酶对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响[J]. 郭雯,赖联贺,张晓梅,史劲松,许正宏. 食品与发酵工业. 2016(09)
[3]微生物合成鸟氨酸的代谢工程研究进展[J]. 卢冬梅. 微生物学通报. 2015(07)
[4]谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用[J]. 还晓静,李坤,史锋,王小元. 生物工程学报. 2012(09)
[5]L-鸟氨酸高产菌的原生质体融合育种[J]. 张婧芳,汪江波,黄金明,张晶. 氨基酸和生物资源. 2009(01)
[6]L-鸟氨酸的生物功能及生产研究[J]. 汪江波,邹玉玲,薛海燕. 食品研究与开发. 2007(03)
[7]L-精氨酸高产菌的选育及基于代谢流量分布的育种机制[J]. 许正宏,熊筱晶,窦文芳,陶文沂. 工业微生物. 2006(04)
[8]具有广泛保健功能的L-鸟氨酸[J]. 胡学智. 食品工业. 2006(01)
[9]L-鸟氨酸快速定量检测方法[J]. 黄爱清,苏国成,王璋. 食品与发酵工业. 2005(12)
[10]L-鸟氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究[J]. 陈宁,潘韵,刘淑云,张克旭. 食品与发酵工业. 2001(01)
硕士论文
[1]辅因子代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸[D]. 占米林.江南大学 2018
[2]Gibson Assembly方法的构建及MEP途径的组合优化[D]. 刘乐山.上海医药工业研究院 2017
本文编号：3222921
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3222921.html
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