生物催化α-酮戊二酸为谷氨酸
发布时间：2021-06-13 05:21
生物催化α-酮戊二酸（2-KG）为L-谷氨酸（Glu）的反应在有机合成及检测试剂领域有重要的应用前景。目前鲜有研究生物催化2-KG为Glu的报道,实现该反应的关键是找到性质优良的谷氨酸脱氢酶（GDH）并实现酶制剂的高效低成本生产。本研究首先依据文献报道的产GDH野生菌菌种信息和NCBI数据库对GDH 进行筛选,化学合成了 BsuGDH、PenGDH、AxyGDH、CsyGDH、CdiGDH、TenGDH六种GDH编码基因,并构建于pET-28a（+）质粒上,再将质粒转化进E.coli BL21（DE3）感受态中成功构建出产酶工程菌。通过对产酶工程菌摇瓶发酵后的酶蛋白可溶性表达、粗酶液酶活、粗酶液热稳定性等因素的比较,筛选得到了可溶性表达好、比酶活高的谷氨酸脱氢酶AxyGDH。随后对AxyGDH的酶学性质进行了表征,发现其最适温度为60℃、最适pH为8.0,在该条件下比酶活达到903.1±24.6 U/mg,酶活半衰期为167 h。同时研究了底物2-KG和NH4+以及常见的金属离子对酶活力的影响,随着反应中底物2-KG和NH4+浓度的提高,酶的催化活力先升后降,分别在2-KG浓度为10 ...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．１?ｐＥＴ－２８⑴－ＭＯＧＤＨ质粒图谱??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?ｐｌａｓｍｉｄ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐＥＴ－２８（＋）－ＭＯＧＤＨ??
２．３．１．２?ＧＤＨ的异源表达??在ＬＢ培养基中摇瓶发酵重组工程菌，在２５?°Ｃ、０．５ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ条件下诱??导１６ｈ后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析，蛋白胶图如图２．２，酶蛋白理论分子大??小及可溶性表迖情况见表２．２。可知五个目标酶均实现过量表达，其中ＰｅｎＧＤＨ、??ＡｘｙＧＤＨ、ＣｓｙＧＤＨ、ＣｄｉＧＤＨ的可溶性表达良好
２．３．１．３?ＧＤＨ的热稳定性比较??分别将产ＡｘｙＧＤＨ、ＣｓｙＧＤＨ、ＣｄｉＧＤＨ的三株重组菌的粗酶液在不同温度??下保存１０?ｍｉｎ后测定残余酶活，实验结果如图２．４。结果表明ＡｘｙＧＤＨ在８０?°Ｃ??下保存１０?ｍｉｎ后仍残余９０％以上的酶活，而ＣｄｉＧＤＨ和ＣｓｙＧＤＨ在３０?°Ｃ下保??存１０?ｍｉｎ后酶活即出现明显下降，ＡｘｙＧＤＨ的热稳定性明显优于ＣｄｉＧＤＨ和??ＣｓｙＧＤＨ，最终选择ＡｘｙＧＤＨ为最佳模板寻找其他ＧＤＨ。??１１０－１???１?〇〇?－?０－＾?４?＾?￣￣■?■??９０：?广?？一??－?▲‘?？？入??？?７０：?？?Ｔ?＼??Ｉ６。：???＼??＾?５０?－?ＡｘｙＧＤＨ??０?—？－ＣｄｉＧＤＨ?▲?ｌ??１?４０?：?＊?ＣｓｖＧＤｈＩ?＼?＼??１?３０；??２０－??？??１０－??？??〇?－?▲?▲?▲??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?１??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０?８０?９０?１００?１１０??Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（°Ｃ）??图２．４温度对酶稳定性的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｓｔａｂｉｌｉｔｙ??１８??
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组aFGF大肠杆菌发酵条件的初步优化[J]. 吴伟,张思远,徐一芩,张锦涛. 湖北理工学院学报. 2017(05)
[2]单因素优化提高重组毕赤酵母β-呋喃果糖苷酶产量[J]. 赵西浩,张慧杰,冯家勋,秦秀林. 基因组学与应用生物学. 2017(09)
[3]利用指数流加补料高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶重组大肠杆菌[J]. 吴彬,裴智鹏,成骋,吴斌,何冰芳. 微生物学通报. 2017(04)
[4]重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生[J]. 余涛,胡蝶,邬敏辰,汪俊卿,冯峰,顾颖. 食品与生物技术学报. 2014(09)
[5]响应面法优化重组大肠杆菌产蔗糖异构酶发酵培养基[J]. 汪晨,李莎,徐虹,魏艳,蔡恒. 中国生物工程杂志. 2011(04)
[6]产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化[J]. 杨海麟,王长城,张玲,孙艳,白洁,王武,杨建勋. 食品与生物技术学报. 2009(05)
[7]温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响[J]. 赵春光,谢希贤,程立坤,徐庆阳,陈宁. 生物技术通讯. 2009(04)
[8]乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达[J]. 陈亮,任随周,许玫英,孙国萍. 微生物学通报. 2009(04)
[9]混合培养微生物利用甘油补料发酵生产乙醇研究[J]. 张宏武,王璐,许赣荣,BLANC Philippe J. 应用与环境生物学报. 2008(05)
[10]重组大肠杆菌发酵生产β1-3,1-4-葡聚糖酶培养基优化研究[J]. 程志敬,邓旭,卢英华,何宁,陈文谋. 工业微生物. 2006(02)
本文编号：3227081
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２．１?ｐＥＴ－２８⑴－ＭＯＧＤＨ质粒图谱??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?ｐｌａｓｍｉｄ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐＥＴ－２８（＋）－ＭＯＧＤＨ??
２．３．１．２?ＧＤＨ的异源表达??在ＬＢ培养基中摇瓶发酵重组工程菌，在２５?°Ｃ、０．５ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ条件下诱??导１６ｈ后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析，蛋白胶图如图２．２，酶蛋白理论分子大??小及可溶性表迖情况见表２．２。可知五个目标酶均实现过量表达，其中ＰｅｎＧＤＨ、??ＡｘｙＧＤＨ、ＣｓｙＧＤＨ、ＣｄｉＧＤＨ的可溶性表达良好
２．３．１．３?ＧＤＨ的热稳定性比较??分别将产ＡｘｙＧＤＨ、ＣｓｙＧＤＨ、ＣｄｉＧＤＨ的三株重组菌的粗酶液在不同温度??下保存１０?ｍｉｎ后测定残余酶活，实验结果如图２．４。结果表明ＡｘｙＧＤＨ在８０?°Ｃ??下保存１０?ｍｉｎ后仍残余９０％以上的酶活，而ＣｄｉＧＤＨ和ＣｓｙＧＤＨ在３０?°Ｃ下保??存１０?ｍｉｎ后酶活即出现明显下降，ＡｘｙＧＤＨ的热稳定性明显优于ＣｄｉＧＤＨ和??ＣｓｙＧＤＨ，最终选择ＡｘｙＧＤＨ为最佳模板寻找其他ＧＤＨ。??１１０－１???１?〇〇?－?０－＾?４?＾?￣￣■?■??９０：?广?？一??－?▲‘?？？入??？?７０：?？?Ｔ?＼??Ｉ６。：???＼??＾?５０?－?ＡｘｙＧＤＨ??０?—？－ＣｄｉＧＤＨ?▲?ｌ??１?４０?：?＊?ＣｓｖＧＤｈＩ?＼?＼??１?３０；??２０－??？??１０－??？??〇?－?▲?▲?▲??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?＇?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?１?Ｉ?１??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０?８０?９０?１００?１１０??Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（°Ｃ）??图２．４温度对酶稳定性的影响??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｓｔａｂｉｌｉｔｙ??１８??
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组aFGF大肠杆菌发酵条件的初步优化[J]. 吴伟,张思远,徐一芩,张锦涛. 湖北理工学院学报. 2017(05)
[2]单因素优化提高重组毕赤酵母β-呋喃果糖苷酶产量[J]. 赵西浩,张慧杰,冯家勋,秦秀林. 基因组学与应用生物学. 2017(09)
[3]利用指数流加补料高密度发酵产β-呋喃果糖苷酶重组大肠杆菌[J]. 吴彬,裴智鹏,成骋,吴斌,何冰芳. 微生物学通报. 2017(04)
[4]重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生[J]. 余涛,胡蝶,邬敏辰,汪俊卿,冯峰,顾颖. 食品与生物技术学报. 2014(09)
[5]响应面法优化重组大肠杆菌产蔗糖异构酶发酵培养基[J]. 汪晨,李莎,徐虹,魏艳,蔡恒. 中国生物工程杂志. 2011(04)
[6]产胆固醇氧化酶重组大肠杆菌的发酵培养基和诱导条件的优化[J]. 杨海麟,王长城,张玲,孙艳,白洁,王武,杨建勋. 食品与生物技术学报. 2009(05)
[7]温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响[J]. 赵春光,谢希贤,程立坤,徐庆阳,陈宁. 生物技术通讯. 2009(04)
[8]乳糖替代IPTG诱导脱色酶TpmD基因在大肠杆菌中的高效表达[J]. 陈亮,任随周,许玫英,孙国萍. 微生物学通报. 2009(04)
[9]混合培养微生物利用甘油补料发酵生产乙醇研究[J]. 张宏武,王璐,许赣荣,BLANC Philippe J. 应用与环境生物学报. 2008(05)
[10]重组大肠杆菌发酵生产β1-3,1-4-葡聚糖酶培养基优化研究[J]. 程志敬,邓旭,卢英华,何宁,陈文谋. 工业微生物. 2006(02)
本文编号：3227081
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