Methylobacterium sp.MB200突变修复基因mutL及转录调控基因trmf的初步研究
发布时间：2021-06-28 17:53
Methylobacterium sp.MB200是本实验室在前期实验研究中分离的一株兼性甲基营养菌,具有合成L-丝氨酸的能力。然而,其对甲醇的低耐受性限制了该菌的进一步应用,较高浓度的甲醇及其浓度的突然变化通常对这些细菌有一定的毒性作用,2.5%（v/v）甲醇可以完全抑制MB200的生长。甘氨酸是利用甲基营养菌进行工业生产L-丝氨酸的重要前体物,在L-丝氨酸生产工程中,添加一定量的甘氨酸可在一定程度上增加L-丝氨酸的产量。本文从甲基营养菌生长所需的底物（甲醇）和L-丝氨酸工业生产重要的前体物（甘氨酸）耐受的角度出发,通过相关基因的研究以期为更好地利用高甲醇或甘氨酸获得高L-丝氨酸产量奠定基础。实验利用自杀质粒pK18mob,构建质粒载体pK18mob-mutlps,三亲本接合的手段构建甲基营养菌M.sp.MB200突变修复基因mutL的插入突变株MB200m TB。以1.6%甲醇含量作为甲醇诱导的初始浓度,以0.2%为一个梯度,逐步增加诱导驯化环境中的甲醇浓度,在不断地驯化诱导下,平板筛选到10株可以在7%甲醇环境中生长的菌株。利用能够在甲基营养菌中进行基因表达的通用广宿主载体p C...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
M.extorquensAM1的甲基代谢模式
广西大学硕士学位论文Methylobacteriumsp.MB200突变修复基因mutL及转录调控基因trmf的初步研究37图3-1PCR扩增的DNA片段Figure3-1ThetargetDNAfragmentamplifiedbyPCR3.1.2扩增基因的验证将扩增产物连接到pMD18-Tvector载体上，命名为pMD18T-MutL，转化进DH5α，在含有抗生素X-gal、IPTG和Amp的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑进行酶切分析鉴定后，送至上海生工进行测序，发现扩增所得DNA全长2195bp，其中MutL基因长度1838bp，通过Genbank进行序列对比分析，发现该片段与Genbank上报道的AM1的mutL基因序列有91%的相似性。其全序列见附录二。3.2MutL基因突变株的构建质粒载体pK18mob是一种自杀质粒，质粒小，拷贝数高，便于DNA操作；携带有多克隆位点供外源片段克隆；带有lac基因，有蓝白斑反应方便重组子的筛眩构建带有目的基因的pK18mob重组质粒，其在进入野生菌株MB200后，可与菌株基因组DNA发生同源单交换，将目标基因插入突变，使之失活。3.2.1MutL基因的克隆根据已扩增出的mutL基因序列，使用VectorNTI设计引物MutL-P1/MutL-P2，使用TaKaRa公司的TaKaRaLATaq聚合酶，对mutL基因内部片段进行扩增。PCR扩增出一条1.0kb大小的DNA片段（图3-2）。
广西大学硕士学位论文Methylobacteriumsp.MB200突变修复基因mutL及转录调控基因trmf的初步研究38图3-2PCR扩增的DNA片段Figure3-2ThetargetDNAfragmentamplifiedbyPCR3.2.2扩增基因的验证将扩增产物连接到pMD18-Tvector载体上，命名为pMD18T-MutLps，转化进E.coliDH5α，在含有抗生素X-gal、IPTG和Amp的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑酶切分析鉴定后，送至上海生工进行测序，发现其全长1074bp，是mutL基因的片段，与实验结果吻合。3.2.3重组质粒pK18mob-mutlps的构建将mutL片段（mutLps）用PstI与HindIII从载体pMD18T-MutLps上酶切下，纯化回收后与同样用PstI与HindIII酶切的pK18mob载体连接，得到重组质粒pK18mob--mutLps，化学转化至E.coliDH5α中。在含抗生素Km、X-Gal和IPTG的LA平板上进行过夜培养，挑取生长出的菌落，提取质粒并限制性内切酶进行酶切鉴定（图3-3）。如图所示，从培养的DH5α中提取的质粒，其在酶切后产生两条条带，其中一条为符合载体大小的条带，另一条符合所插入的DNA大小的条带，证明重组质粒pK18mob-mutlps被成功转化进感受态细胞E.coliDH5α中。
【参考文献】：
期刊论文
[1]甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定[J]. 徐文,许然,张利平. 生物技术通报. 2013(01)
[2]QscR基因的调控对菌株M.sp.SDM11产L-丝氨酸的影响[J]. 孔庆胜,张向阳,韩晓琳,林强,董全林. 生物技术通报. 2011(02)
[3]甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200中部分一碳代谢相关基因的定位及mtdA和mtdB基因的克隆研究[J]. 宋修鹏,武波,申佩弘,蒋承建,田丹丹,唐咸来. 中国生物工程杂志. 2011(02)
[4]甲基营养菌的研究进展[J]. 晁红军,宋修鹏,孙继华,申佩弘,武波. 微生物学通报. 2009(11)
[5]甲基营养型L-丝氨酸产生菌的选育[J]. 张超,栾兴社,张维建,侯书国. 生物加工过程. 2009(03)
[6]L-丝氨酸高产菌的选育及其发酵条件[J]. 左爱连,张伟国. 化工进展. 2008(09)
[7]甲醇利用菌MB200丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因（sga）的克隆、突变及对产L-丝氨酸的影响[J]. 申佩弘,王亚莉,武波. 工业微生物. 2008(01)
[8]L-丝氨酸产生菌c-11中serA基因的克隆与表达[J]. 谢玉清,罗淑萍,茆军. 新疆农业科学. 2007(05)
[9]丝氨酸生产菌的筛选及静息细胞培养系统中L-丝氨酸的合成[J]. 欧倩,韦东,武波. 氨基酸和生物资源. 2006(03)
[10]L-丝氨酸高产菌株的选育和摇瓶发酵条件优化[J]. 魏东,谭慧林,杨海燕,崔春生,殷丽霞. 氨基酸和生物资源. 2006(01)
博士论文
[1]甲基营养菌Methylobacterium sp MB200中丝氨酸循环相关基因（glyA、hpr）的研究与应用[D]. 申佩弘.广西大学 2007
本文编号：3254779
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
M.extorquensAM1的甲基代谢模式
广西大学硕士学位论文Methylobacteriumsp.MB200突变修复基因mutL及转录调控基因trmf的初步研究37图3-1PCR扩增的DNA片段Figure3-1ThetargetDNAfragmentamplifiedbyPCR3.1.2扩增基因的验证将扩增产物连接到pMD18-Tvector载体上，命名为pMD18T-MutL，转化进DH5α，在含有抗生素X-gal、IPTG和Amp的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑进行酶切分析鉴定后，送至上海生工进行测序，发现扩增所得DNA全长2195bp，其中MutL基因长度1838bp，通过Genbank进行序列对比分析，发现该片段与Genbank上报道的AM1的mutL基因序列有91%的相似性。其全序列见附录二。3.2MutL基因突变株的构建质粒载体pK18mob是一种自杀质粒，质粒小，拷贝数高，便于DNA操作；携带有多克隆位点供外源片段克隆；带有lac基因，有蓝白斑反应方便重组子的筛眩构建带有目的基因的pK18mob重组质粒，其在进入野生菌株MB200后，可与菌株基因组DNA发生同源单交换，将目标基因插入突变，使之失活。3.2.1MutL基因的克隆根据已扩增出的mutL基因序列，使用VectorNTI设计引物MutL-P1/MutL-P2，使用TaKaRa公司的TaKaRaLATaq聚合酶，对mutL基因内部片段进行扩增。PCR扩增出一条1.0kb大小的DNA片段（图3-2）。
广西大学硕士学位论文Methylobacteriumsp.MB200突变修复基因mutL及转录调控基因trmf的初步研究38图3-2PCR扩增的DNA片段Figure3-2ThetargetDNAfragmentamplifiedbyPCR3.2.2扩增基因的验证将扩增产物连接到pMD18-Tvector载体上，命名为pMD18T-MutLps，转化进E.coliDH5α，在含有抗生素X-gal、IPTG和Amp的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑酶切分析鉴定后，送至上海生工进行测序，发现其全长1074bp，是mutL基因的片段，与实验结果吻合。3.2.3重组质粒pK18mob-mutlps的构建将mutL片段（mutLps）用PstI与HindIII从载体pMD18T-MutLps上酶切下，纯化回收后与同样用PstI与HindIII酶切的pK18mob载体连接，得到重组质粒pK18mob--mutLps，化学转化至E.coliDH5α中。在含抗生素Km、X-Gal和IPTG的LA平板上进行过夜培养，挑取生长出的菌落，提取质粒并限制性内切酶进行酶切鉴定（图3-3）。如图所示，从培养的DH5α中提取的质粒，其在酶切后产生两条条带，其中一条为符合载体大小的条带，另一条符合所插入的DNA大小的条带，证明重组质粒pK18mob-mutlps被成功转化进感受态细胞E.coliDH5α中。
【参考文献】：
期刊论文
[1]甲醇利用型吡咯喹啉醌产生菌的筛选及鉴定[J]. 徐文,许然,张利平. 生物技术通报. 2013(01)
[2]QscR基因的调控对菌株M.sp.SDM11产L-丝氨酸的影响[J]. 孔庆胜,张向阳,韩晓琳,林强,董全林. 生物技术通报. 2011(02)
[3]甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200中部分一碳代谢相关基因的定位及mtdA和mtdB基因的克隆研究[J]. 宋修鹏,武波,申佩弘,蒋承建,田丹丹,唐咸来. 中国生物工程杂志. 2011(02)
[4]甲基营养菌的研究进展[J]. 晁红军,宋修鹏,孙继华,申佩弘,武波. 微生物学通报. 2009(11)
[5]甲基营养型L-丝氨酸产生菌的选育[J]. 张超,栾兴社,张维建,侯书国. 生物加工过程. 2009(03)
[6]L-丝氨酸高产菌的选育及其发酵条件[J]. 左爱连,张伟国. 化工进展. 2008(09)
[7]甲醇利用菌MB200丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因（sga）的克隆、突变及对产L-丝氨酸的影响[J]. 申佩弘,王亚莉,武波. 工业微生物. 2008(01)
[8]L-丝氨酸产生菌c-11中serA基因的克隆与表达[J]. 谢玉清,罗淑萍,茆军. 新疆农业科学. 2007(05)
[9]丝氨酸生产菌的筛选及静息细胞培养系统中L-丝氨酸的合成[J]. 欧倩,韦东,武波. 氨基酸和生物资源. 2006(03)
[10]L-丝氨酸高产菌株的选育和摇瓶发酵条件优化[J]. 魏东,谭慧林,杨海燕,崔春生,殷丽霞. 氨基酸和生物资源. 2006(01)
博士论文
[1]甲基营养菌Methylobacterium sp MB200中丝氨酸循环相关基因（glyA、hpr）的研究与应用[D]. 申佩弘.广西大学 2007
本文编号：3254779
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