利用分子改造技术提高富马酸酶的热稳定性

发布时间：2021-07-14 18:22

　　富马酸酶（fumarase,EC4.2.1.2）是三羧酸循环中的关键酶之一,催化富马酸转化为L-苹果酸这一可逆反应。由于具有相对较好的热稳定性且反应不依赖于铁离子,其中的富马酸酶C（FumC）被应用于L-苹果酸的工业生产。随着国家对环保的日益重视和环保税的开征,企业在节能降耗减排方面的需求也与日俱增。进一步提高FumC的稳定性,不但可以降低固定化酶在工业使用环境下的失活速率,延长其使用寿命,而且有利于降低单位产品的原料和能源消耗,减少污染物排放,具有重要的经济和社会效益。本论文在调研国内外文献的基础上,选取了五种不同来源的FumC基因,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行克隆表达,基于单位发酵液体积的酶活与纯酶比酶活的测定和比较,选取了来源于大肠杆菌的FumC（EEF）和来源于谷氨酸棒状杆菌的FumC（EGF）进行转化率和稳定性的研究。将含这两种酶的重组菌全细胞固定化,考察其催化富马酸产L-苹果酸的反应,结果表明,两者对底物的转化率都能达到80%左右,且在持续22个反应批次间转化率都没有明显下降,均具有工业应用的潜力。所以,选择这两种FumC同时进行热稳定性的改造。首先,以EGF为亲本,... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：111 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．３?ＩＩ类富马酸酶单体的结构示意图??Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｃｌａｓｓ?ＩＩ?ｆｕｍａｒａｓｅ?ｍｏｎｏｍｅｒ??

ＩＩ类富马酸酶四聚体的每个亚基都是由Ｄｌ，Ｄ２和Ｄ３这三个结构域形成的??哑钤状的单体结构。Ｄ１始于Ｎ末端，Ｄ３位于多肽链的Ｃ末端，中心域Ｄ２由一??个独特的五螺旋束组成。ＩＩ类富马酸酶单体的结构示意图见图１．３［Ｍ］，图中的红??色、绿色和紫色三部分代表了超家族内并置的三个高度保守区域，分别为区域一、??区域二和区域三。ＩＩ类富马酸酶四聚体的结构示意图见图１．４［２３】，在四聚体结构??中，四个Ｄ２结构域的结合形成了含有２０个几乎平行的ａ－螺旋的核心。另外两个??结构域Ｄ１和Ｄ３拓展了核心单元的顶部，底部和两侧，并在四聚体的上下两端??盖住了螺旋束。ＩＩ类富马酸酶中的三个保守区域在单体结构上是互不相邻的，图??中的红色就表示了在同一个亚基内的三个保守区域。但来自三个不同亚基的三个??保守区域在四聚体中却是以并列的方式排列在一起，区域中的氨基酸侧链聚合形??成了酶的活性位点，活性位点位于Ｄ１和Ｄ２结构域之间。图１．４中活性位点的??紫色

浙江大学硕士论文?玄献综诂??图１．４?ＩＩ类富马酸酶四聚体的结构示意图??Ｆｉｇ．?１．４?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｃｌａｓｓ?ＩＩ?ｆｕｍａｒａｓｅ?ｔｅｔｒａｍｅｒ??在大肠杆菌ＦｕｍＣ和酵母ｆｕｍａｒａｓｅ的中均发现了与活性位点上的氨基酸残??基形成了氢键的水分子，说明水分子在酶的催化过程中起到了重要的作用。有些??ＩＩ类富马酸酶还能被底物或其它二羧酸及阴离子在活性位点之外的第二结合位??点激活。例如大肠杆菌的ＦｕｍＣ不但能因柠檬酸与活性位点（ｓｉｔｅＡ）的结合而??被激活，也能因Ｌ－苹果酸结合到活性位点附近约１２?Ａ的二羧酸结合位点（ｓｉｔｅ?Ｂ）??后被激活。由于Ｌ－苹果酸在该反应中起到了激活剂的作用，因此认为该第二结??合位点是激活因子的激活位点（ａｃｔｉｖａｔｏｒｓｉｔｅ）。活性位点是由来自三个亚基的??三个保守区域共同形成的结构，而激活位点是由一个亚基单独形成［３（）］。??１．２．３富马酸酶热稳定性的研究现状??由于富马酸酶应用于工业生产Ｌ－苹果酸时具有工艺简单，转化率高的优点，??故受到生产Ｌ－苹果酸的厂家的重视。考虑到生产过程中的操作便捷性和生产的??成本，工业上基本采用全细胞来催化富马酸生产Ｌ－苹果酸。但是在反应温度不??高的条件下，细胞中的琥珀酸脱氢酶和其他杂酶会催化富马酸生成琥珀酸等副产??物

【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质定向进化技术概述[J]. 王松明,顾招兵,朱雅新,冷静,冯励,李清,杨舒黎.  中国饲料. 2017(14)
[2]两种不同来源富马酸酶酶学性质比较[J]. 吴四平,陆阳,刘均忠,刘茜,焦庆才.  发酵科技通讯. 2016(01)
[3]酶定向进化方法的研究进展[J]. 张林,朱小翌,江明锋.  中国畜牧兽医. 2013(08)
[4]L-苹果酸生物合成研究进展[J]. 吴军林,吴清平,张菊梅,张文,莫树平,柏建玲.  食品科学. 2014(03)
[5]易错PCR研究进展及应用[J]. 高义平,赵和,吕孟雨,杨学举,王海波.  核农学报. 2013(05)
[6]蛋白质体外定向进化策略研究进展[J]. 付畅,林海龙,李海莹,王得江.  生物技术通报. 2012(07)
[7]S-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化及其应用[J]. 刘鹏,林春娇,杨立荣,徐刚,吴坚平.  中国生物工程杂志. 2012(05)
[8]全生物法生产L-苹果酸的研究进展[J]. 林海龙.  安徽农业科学. 2011(03)
[9]L-苹果酸的生理功能研究进展[J]. 吴军林,吴清平,张菊梅.  食品科学. 2008(11)
[10]甘油脱水酶的理性设计:基因杂合改善酶的性质[J]. 齐向辉,罗兆飞,吴杰群,孟晓蕾,唐悦,韦宇拓,黄日波.  科学通报. 2006(20)



本文编号：3284651