提高酿酒酵母异戊二烯产量的代谢途径的挖掘
发布时间：2021-07-22 04:09
异戊二烯（Isoprene）是一种具有挥发性和疏水性的萜类烃分子,是萜类化合物的组成骨架,在橡胶、香水和农药制造等领域有着广泛的工业应用。目前主要以石油作为原料获得异戊二烯,但随着石油资源的日益枯竭及其使用所带来的污染使得异戊二烯的生产受到限制,亟需一种绿色无污染且可持续的异戊二烯合成方法。而近年来随着生物合成技术的不断崛起,通过微生物合成异戊二烯成为了当前研究的热点。其中酿酒酵母作为真核类模式菌株,不仅具有清楚的遗传背景、高糖代谢分解速率和较强的适应工业工艺条件能力等优点,而且具有天然类异戊二烯合成途径通量高的优点,因而是生产异戊二烯类产品的良好宿主。本研究以酿酒酵母作为底盘细胞,通过增加细胞质中乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）通量、筛选甲羟戊酸（MVA）途径关键酶等来挖掘增加异戊二烯合成产量的新途径。具体结果如下:（1）通过敲除乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）通往线粒体支流的基因来增加细胞质中乙酰辅酶A的通量。敲除线粒体丙酮酸载体基因（MPC2）、线粒体孔蛋白基因（POR2）和丙酮酸脱氢酶复合体的Elα亚基基因（PDA1）来切断Acetyl-CoA通往线粒体的支流来挖掘提高酿酒...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MVA代谢途径与MEP代谢途径Figure.1-1MVAmetabolicpathwayandMEPmetabolicpathwayIDI酶是由IDI1基因编码，是下游MVA途径上的一个重要的限速酶[44]
第二章材料与方法13有目的基因两端的同源臂的片段，同源臂的选择可根据已经报道的对细胞生长没有影响的序列[58]，该片段上有3个主要元件：同源臂、KanMX筛选标记和loxP位点。将片段导入细胞，片段会利用目的基因两端的同源臂定位到要敲除的基因处，然后带有loxP位点的筛选标记会将目的基因替换掉。原理图2-1：其原理为双交换同源重组。图2-1.双交换同源重组原理图Figure.2-1.Schematicdiagramofdoubleexchangehomologousrecombination2.2.3.3基因敲除步骤选取MPC2、POR2和PDA1基因同源臂左右各50bp，以pUG6质粒[59]为模板，用MPC2-F和MPC2-R扩增KanMX基因，约1700bp。PCR反应体系如下：表2.6MPC2、POR2和PDA1基因的PCR扩增体系Table.2.6ThegeneofMPC2、POR2andPDA1forPCRamplification试剂加入量（μL）上游引物2下游引物2DNA模板1PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ddH2O3810×buffer5dNTPMix1PCR反应程序见2.2.1。采用琼脂糖凝胶电泳胶回收的方式纯化PCR产物，纯化步骤见2.2.1；同理，用PDA1-F、PDA1-R和POR2-F、POR2-R扩增，获得相应的KanMX片段，约1700bp。然后用醋酸锂化学转化方法[60]将PCR扩增出来的3个片段分别转入CEN.PK2-1C中，30℃培养2-4天。然后挑取转化子，以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组作为对照，以MPC2-TEST-F、MPC2-TEST-R；PDA-TEST-F、PDA-TEST-R和POR2-TEST-F、POR2-TEST–R进行菌落PCR验证。PCR反应程序见2.2.1。根据摇瓶发酵结果，继续在敲除基因PDA1的基础上，选取MPC2、POR2基因同源臂左右各50bp，以pUG6质粒[59]为模板，用MPC2-F、MPC2-R和POR2-F、POR2-R扩增KanMX基因，约1700bp。PCR扩增程序同上。然后用醋酸锂化学转化方法[60]将PCR扩增出来的2个片段分别转入基因PDA1的酿酒酵母感受态细胞中
江南大学硕士学位论文14证（引物见表2.7）。2.2.3.4重组菌基因组中筛选标记KanMX的去除实验原理：Cre重组酶（CauseRecombinationEnzyme）是一种最早发现于P1噬菌体且可以对loxP位点靶向识别，并催化其断裂及重新连接的DNA重组酶。巴斯德毕赤酵母质粒pGAPzα可以编码Cre重组酶。经过人工修饰的KanMX抗性基因在两侧都具有相同方向的loxP位点，而Cre重组酶可以对loxP位点之间进行重组，使loxP位点之间的部分成环连接并弹出，从而去除了KanMX筛选标记。其重组去除的过程如图2-2所示。图2-2.KanMX筛选标记去除原理图Figure.2-2KanMXscreeningmarkerremovalschematic实验步骤如图2-3。图2-3.KanMX筛选标记去除步骤Figure2-3.TheprocedureofKanMXscreeningmarkerremoval表2.7敲除基因PDA1，MPC2，POR2所需要的引物Table.2.7PrimersofknockoutgenesPDA1,MPC2,POR2引物名称引物序列（5′–3′）MPC2-FAAAATTGACACACGAATTATATAAACGAAGTTATACAGAAAAAGATTAAAGAAAAGAAAACAGCTGAAGCTTCGTACGCMPC2-RATATATATGCTTACGTACATATCTTTGACAAAGCAAAGTTTCGAGTTGTAAATTCGGCGTGCATAGGCCACTAGTGGAPOR2-FTCTGTTTTATTCTCGAGTGAAGGAATTGCATGAAGAGGAAAGTGTTAGAAATTACCTACGCAGCTGAAGCTTCGTACGC
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同来源异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）和脱氧木酮糖磷酸合成酶（DXS）对重组大肠杆菌番茄红素产量的影响[J]. 杨帆,苏卜利,姚青,李华平,朱红惠. 食品工业科技. 2018(18)
[2]异戊二烯及其下游产业应用分析[J]. 罗淇元. 产业与科技论坛. 2013(06)
本文编号：3296406
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MVA代谢途径与MEP代谢途径Figure.1-1MVAmetabolicpathwayandMEPmetabolicpathwayIDI酶是由IDI1基因编码，是下游MVA途径上的一个重要的限速酶[44]
第二章材料与方法13有目的基因两端的同源臂的片段，同源臂的选择可根据已经报道的对细胞生长没有影响的序列[58]，该片段上有3个主要元件：同源臂、KanMX筛选标记和loxP位点。将片段导入细胞，片段会利用目的基因两端的同源臂定位到要敲除的基因处，然后带有loxP位点的筛选标记会将目的基因替换掉。原理图2-1：其原理为双交换同源重组。图2-1.双交换同源重组原理图Figure.2-1.Schematicdiagramofdoubleexchangehomologousrecombination2.2.3.3基因敲除步骤选取MPC2、POR2和PDA1基因同源臂左右各50bp，以pUG6质粒[59]为模板，用MPC2-F和MPC2-R扩增KanMX基因，约1700bp。PCR反应体系如下：表2.6MPC2、POR2和PDA1基因的PCR扩增体系Table.2.6ThegeneofMPC2、POR2andPDA1forPCRamplification试剂加入量（μL）上游引物2下游引物2DNA模板1PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ddH2O3810×buffer5dNTPMix1PCR反应程序见2.2.1。采用琼脂糖凝胶电泳胶回收的方式纯化PCR产物，纯化步骤见2.2.1；同理，用PDA1-F、PDA1-R和POR2-F、POR2-R扩增，获得相应的KanMX片段，约1700bp。然后用醋酸锂化学转化方法[60]将PCR扩增出来的3个片段分别转入CEN.PK2-1C中，30℃培养2-4天。然后挑取转化子，以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组作为对照，以MPC2-TEST-F、MPC2-TEST-R；PDA-TEST-F、PDA-TEST-R和POR2-TEST-F、POR2-TEST–R进行菌落PCR验证。PCR反应程序见2.2.1。根据摇瓶发酵结果，继续在敲除基因PDA1的基础上，选取MPC2、POR2基因同源臂左右各50bp，以pUG6质粒[59]为模板，用MPC2-F、MPC2-R和POR2-F、POR2-R扩增KanMX基因，约1700bp。PCR扩增程序同上。然后用醋酸锂化学转化方法[60]将PCR扩增出来的2个片段分别转入基因PDA1的酿酒酵母感受态细胞中
江南大学硕士学位论文14证（引物见表2.7）。2.2.3.4重组菌基因组中筛选标记KanMX的去除实验原理：Cre重组酶（CauseRecombinationEnzyme）是一种最早发现于P1噬菌体且可以对loxP位点靶向识别，并催化其断裂及重新连接的DNA重组酶。巴斯德毕赤酵母质粒pGAPzα可以编码Cre重组酶。经过人工修饰的KanMX抗性基因在两侧都具有相同方向的loxP位点，而Cre重组酶可以对loxP位点之间进行重组，使loxP位点之间的部分成环连接并弹出，从而去除了KanMX筛选标记。其重组去除的过程如图2-2所示。图2-2.KanMX筛选标记去除原理图Figure.2-2KanMXscreeningmarkerremovalschematic实验步骤如图2-3。图2-3.KanMX筛选标记去除步骤Figure2-3.TheprocedureofKanMXscreeningmarkerremoval表2.7敲除基因PDA1，MPC2，POR2所需要的引物Table.2.7PrimersofknockoutgenesPDA1,MPC2,POR2引物名称引物序列（5′–3′）MPC2-FAAAATTGACACACGAATTATATAAACGAAGTTATACAGAAAAAGATTAAAGAAAAGAAAACAGCTGAAGCTTCGTACGCMPC2-RATATATATGCTTACGTACATATCTTTGACAAAGCAAAGTTTCGAGTTGTAAATTCGGCGTGCATAGGCCACTAGTGGAPOR2-FTCTGTTTTATTCTCGAGTGAAGGAATTGCATGAAGAGGAAAGTGTTAGAAATTACCTACGCAGCTGAAGCTTCGTACGC
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同来源异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）和脱氧木酮糖磷酸合成酶（DXS）对重组大肠杆菌番茄红素产量的影响[J]. 杨帆,苏卜利,姚青,李华平,朱红惠. 食品工业科技. 2018(18)
[2]异戊二烯及其下游产业应用分析[J]. 罗淇元. 产业与科技论坛. 2013(06)
本文编号：3296406
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