双水相耦合硼酸亲和吸附技术分离纯化辣根过氧化物酶

发布时间：2021-08-02 05:30

　　辣根过氧化物酶（HRP）是一种由无色蛋白质和棕色铁卟啉组成的糖蛋白。目前,HRP广泛用于污水处理、食品工业和催化反应。然而,HRP提纯于植物,在纯化过程中很容易失活,使其生产成本普遍较高。严重阻碍了蛋白质在工业生产中的应用。因此,提高蛋白质分离和纯化的效率是生物工程领域的热门话题。本课题将双水相初步萃取法和多价苯硼酸磁性石墨烯材料进一步吸附分离相耦合应用于纯化辣根过氧化物酶,并取得了良好的效果,具体工作内容如下:（1）构建17R4/L35-盐双水相萃取体系初步分离纯化蛋白质。实验研究了17R4/L35浓度、盐的质量分数以及控温沉淀中电解质、pH对蛋白质分配效率的影响。优化实验条件如下:聚合物选用17R4,盐选用（NH₄）₂SO₄,萃取温度为20℃,控温沉淀时,加入电解质为柠檬酸三钠、体系pH=7.0、控制温度为30℃,此时体系的蛋白质的回收率为70-80%,取得了良好的初级分离纯化的效果。在本实验中,为了模拟辣根中未知的物质和环境,我们建立了模型实验,研究了9种目标物（糖类、色素、蛋白质）的分配情况。调节体系pH值、改变... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

HRP的二级结构示意图[1]

35等领域的分离纯化环节。早在1896年，科学家Beijerinck将一定量的明胶和琼脂混合成溶液，发现了两相分离的现象，称双水相现象。1956年，Albertsson通过ATPS分离纯化叶绿素，开创了ATPS在分离纯化方面的应用先河；随后，德国的Kula等研究者们又利用ATPS对其他生物活性物质实现了分离纯化，并取得了成功。此后，ATPE因具有水溶性好、生物相容性好、工艺流程简单和易于分离等优点，从而取代了传统液液萃取的方法而广泛使用，尤其适用于蛋白质36、细胞器37、抗体38、纳米粒子39和其他的一些生物分子40的分离纯化。图1.2双水相示意图Figure1.2Schematicdiagramofaqueoustwophase1.2.1双水相体系的分类在20世纪60年代，研究工作者研究的方向主要聚集在由聚合物-聚合物双水相体系。由于聚合物-聚合物双水相体系粘度大、产物难分离和容易破坏生物活性物质的结构。因此，聚合物-聚合物双水相体系不适用于分离纯化生物物质。为了扩大双水相体系的应用领域，研究工作者通过不断地试验发现了更多的物质可以作为成相物质，引入到双水相体系中。根据双水相体系的成相物质不同，可以将体系分为以下几种：聚合物-盐双水相体系、聚合物-聚合物双水相体系、亲水性有机溶剂-盐双水相体系、表面活性剂-表面活性剂双水相体系和离子液体-盐双水相体系等，常见的成相物质如表1.1所示。由于双水相体系的成相物质不同，它们的性质和应用领域也不同，例如：食品、生物工程、环境化学和医疗保健等领域的分离纯化环节。迄今为止应用最广泛的双水相体系是聚合物-盐双水相体系，具有两相界面张力小生物相容性好，分相速度快和绿色环保等优点。该

江苏大学硕士学位论文11An63等人通过表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP)成功地合成了氧化石墨烯的聚合物刷(GO@PVPBA)，用于从复杂环境中选择性分离纯化糖蛋白。GO@PVPBA纳米复合材料显示出高表面积和出色的磁容量。同时，SI-ATRP将高密度的硼酸聚合物刷固定在GO表面。可以从复杂系统中选择性富集糖蛋白-蛋白卵清蛋白(OVA)、转铁蛋白(Trf)，证明了GO@PVPBA纳米复合材料的选择性识别能力。此外，GO@PVPBA纳米复合材料还显示出对OVA和Trf的高结合能力，吸附量分别达到514.8和445.9mg·g-1。因此，GO@PVPBA纳米复合材料在生物环境中表现出更高的吸收能力和对糖蛋白的良好特异性。这项工作为表面功能化磁性氧化石墨烯在复杂系统中选择性分离和富集蛋白质提供了新的思路。图1.4利用功能化磁性材料进行生物分离的流程示意图[64]Figure1.4SchematicdiagramoftheprocessofbiologicalseparationusingfunctionalmagneticmaterialsMolday等人64采用了磁性材料分离细胞。他们运用了荧光标记了磁性微球，然后与外源凝集素以及抗体进行偶联，选择性磁性微球分离出红细胞和淋巴B细胞，流程如图1.4所示。Martinez等人将具有炔雌醇抗体的磁性材料和多壁碳纳米管修饰的玻碳电极联用，成功构建了对于水中炔雌醇具有高选择性的高灵敏生物分离和电化学检测方法，最低定量限为0.01ng/L，相对标准偏差<4.20%65。Anja等人利用了疏水烷基胺磁性材料实现了分离纯化蛋白质以及酶的转化，分离纯化效率高达87%以上66。相比与传统的细胞分离技术，磁性分离在外加磁场

【参考文献】：
期刊论文
[1]微乳液中酶催化木素-酚共聚物的性能研究[J]. 邱龙辉,黄开勋,李良智,史大永,周远明,刘均洪.  青岛化工学院学报(自然科学版). 2001(02)
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本文编号：3316986