组合策略提高脂肪酶A在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

发布时间：2021-09-01 12:41

　　脂肪酶能将甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸,同时也能催化酯化反应和酯交换反应,广泛应用于洗涤剂和食品行业,化工合成以及医药领域。来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168的脂肪酶（Lipase A,LipA）相较于其他脂肪酶具有如下特点:分子量小,缺少盖子结构,无界面活化现象,对C8底物有偏好性,并具有良好的碱耐受性。LipA以其显著的特性被深入研究,已报道多种不同特性的突变体,但目前的分泌表达量较低。本论文旨在使用组合策略提高LipA在缺失六个胞外蛋白酶的枯草芽孢杆菌WB600中的分泌表达量,以便于LipA后续的研究。为了实现LipA的有效分泌表达,我们比较了不同信号肽的分泌效率以及不同启动子和双启动子的启动强度。在LB培养基中37 ^oC培养12小时后,含有信号肽SP_lipA和双启动子P₄₃-P_hag的重组菌株B.subtilis L25拥有最高的分泌表达量,胞外脂肪酶的酶活为64.9 U/m L。通过对发酵温度和时间以及不同商业培养基的探索,本研究确定最适于重组菌株B.subt... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

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同源重组技术路线图

华南理工大学硕士学位论文342.4结果与分析2.4.1pMAL0载体构建图2-3LipAPCR扩增片段Fig.2-3PCRamplifiedfragmentsLipA和pMA5qPCR结果见图2-3，与理论片段大小相符，重组后的转化子菌落PCR结果见图2-4，挑取2#菌株送上海生工测序，测序结果正确。图2-4菌落PCRFig.2-4ColonyPCR1：LipAPCR片段；2和3分别为pMA5qPCR扩增片段M1：DL2000DNAMarker；M2：DL15000DNAMarker1M123M2750bp500bp5000bp2500bp2000bpM123456781000bp500bp250bp1-8：pMAL0转化子菌落PCR结果，M：DL2000DNAMarker

第二章信号肽对脂肪酶A分泌效率的影响352.4.2pMAL1-10载体构建图2-5B.subtilis168基因组电泳图Fig.2-5ElectrophoresisofB.subtilis168genome图2-6PCR扩增片段Fig.2-6ElectrophoresisofamplifiedfragmentsM11：B.subtilis168基因组电泳图，M：15000DNAMarker15000bp1、2分别为载体pMAL0PCR扩增片段，3-12分别为信号肽SPamyE，SPaprE，SPbpr，SPepr，SPmpr,SPnprB，SPnprE，SPphoB，SPyhfM，SPywmCPCR扩增片段，M1：5000DNAMarker，M2：2000DNAMarkerM11234567M289101112250bp100bp5000bp3000bp


本文编号：3377000