恶臭假单胞菌MCCC 1A00316作用线虫活性物质分离鉴定和其产生的2-十一烷酮触杀线虫机制研究
发布时间：2021-09-05 01:06
近年来,南方根结线虫已成为危害农业生产的第二大病害。化学防治方法的使用效果虽然明显,但带来了诸多的负面作用,比如环境污染、危及人畜安全和容易产生抗药性根结线虫等,因此亟待需要具有环境友好型特点的防治方法,其中生物防治方法受到越来越多的关注,生物类防治剂研发成为研究的热点。本研究从南极土壤分离的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）MCCC 1A00316的次级代谢产物中分离和鉴定了多种对南方根结线虫具有杀线虫活性的物质,然后对功能突出的挥发性杀线虫活性物质2-十一烷酮作用秀丽隐杆线虫的靶标蛋白和信号通路进行了研究。主要的研究结果如下:（1）通过分离和鉴定发现了一个新功能杀线虫活性物质对恶臭假单胞菌1A00316的发酵液中杀线虫的次级代谢产物进一步研究,分离纯化得到了一个具有杀线虫活性的新功能天然产物,经鉴定和结构解析,确定该物质的分子构成和绝对构型为环二肽cyclo（L-Pro-L-Leu）。该物质对南方根结线虫幼虫具有较强的杀线虫活性和一定的卵孵化抑制能力。（2）研究了菌液产生的挥发性活性物质的多种作用模式通过三格平皿实验确定了恶臭假单胞菌1A00316能产生挥发性的杀...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
秀丽隐杆线虫细胞坏死机制（Syntichakietal2002b）
恶臭假单胞菌MCCC1A00316杀线虫物质分离鉴定和其产生的2-十一烷酮触杀线虫机制研究9图1.1秀丽隐杆线虫细胞坏死机制（Syntichakietal2002b）Fig.1.1CellnecrosismechanismofC.elegansGeng等（2012）人发现乙型感染病毒蛋白HBx直接与凋亡抑制蛋白CED-9（与人Bcl-2蛋白同源）结合，诱导秀丽隐杆线虫钙离子浓度显著升高。此外发现凋亡和坏死信号通路的的几个突变体对HBx均不敏感（死亡率比对照组低），证明了乙型感染病毒蛋白HBx可以诱导细胞凋亡和细胞坏死导致秀丽隐杆线虫死亡（图1.2）。图1.2HBx诱导秀丽隐杆线虫凋亡和坏死信号通路（Gengetal2012）Fig.1.2HBx-inducedapoptosisandnecrosispathwaysinC.elegans由于苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis）产生的晶体蛋白（crystalproteins）毒素对昆虫和线虫具有特异性的毒性，因此一直是科学界研究的热点。Zhang等（2015）发现苏云金芽胞杆菌产生的晶体蛋白Cry6Aa使秀丽隐杆线虫内钙离子浓
、肠道细胞膜破坏和出现死亡荧光等现象，这些特征与细胞坏死高度契合。Li等（2018）从中国狗牙花中分离鉴定了四个vobasinyl-ibogan类型的双吲哚生物碱，该类物质导致秀丽隐杆线虫巨噬样细胞溶酶体异常增大，其中物质HEC-23的增大效应最强。HEC-23特异性的作用于细胞中溶酶体细胞器，降低溶酶体的降解能力，死亡细胞出现累积，加剧了线虫死亡。HEC-23在哺乳动物细胞也出现类似的现象，并发现HEC-23是通过激活STAT3信号通路诱导了下游的溶酶体增大，提升了溶酶体膜的渗透性，随后引起组织蛋白酶的释放和细胞坏死（图1.3）。图1.3HEC-23诱导溶酶体增大和细胞死亡模式图（Lietal2018）Fig.1.3SchematicdiagramofHEC23-inducedlysosomalenlargementandcelldeath3.2利用“特洛伊木马”策略2010年发表在PNAS的一篇文章报道了病原细菌通过“特洛伊木马”的方式杀死线虫的机制。张克勤研究团队为了揭示细菌的杀线虫机理，首先从土壤中筛选到一株杀线虫活性较高的食线虫芽胞杆菌（Bacillusnematocida）B16，然后利用倒扣平板实验证明了B16菌株比普通的大肠杆菌对线虫更有吸引能力，分析认为B16菌株产生了挥发性的吸引物质，通过SPME-GC/MS联用技术和后续的纯品检测发现并证明了吸引线虫的挥发性物质是2-庚酮和苯甲醛等。B16菌正是借助吸引性物质吸引线虫并成功侵染到线虫体内，该细菌使用的策略与古希腊神话故事中出现的特洛伊战争中用于引诱敌人的方式很相似，因此得名“特洛伊木马”机制。作者随后通过蛋白质的基因敲除、荧光蛋白定位、异源/同源表达和显微注射等实验，确定了B16菌在进入线虫体内后会产生极强毒性的胞外蛋白酶Bace16和Bae16，这两个胞外蛋白酶作为侵染靶点和之间的协同作用在细菌对线虫的侵染过程发挥了重要的作用，破坏了线虫的肠道，?
【参考文献】：
期刊论文
[1]氨基寡糖素复配噻唑膦对柑橘线虫的防治试验[J]. 郑获,曾锦冰,李次平,叶宇平. 农业与技术. 2017(11)
[2]蔬菜根结线虫病防治技术[J]. 李晓娟. 蔬菜. 2014(01)
[3]多棘蜈蚣化学成分的研究（I）[J]. 付银丹,李振麟,濮社班,钱士辉. 中草药. 2013(13)
[4]测定生物样本中神经酰胺含量的HPLC-FLD法[J]. 娄婷婷,李英娴,方步武,刘文东,董伟林,张庆伟,薛春兰. 药物分析杂志. 2012(10)
[5]番茄根结线虫研究进展[J]. 李戌清,郑经武,郑积荣,阮松林. 浙江农业学报. 2012(04)
[6]根结线虫引起的植物根结形态与形成机理研究进展[J]. 王新荣,马超,任路路,王磊. 华中农业大学学报. 2010(02)
[7]鲁西北保护地蔬菜根结线虫病发生危害及防治措施[J]. 任爱芝,赵培宝,杜学林. 种子. 2005(10)
[8]阿维菌素类药物的研究进展[J]. 徐汉虹,梁明龙,胡林. 华南农业大学学报. 2005(01)
[9]杀线虫剂主要类型、特性及其作用机制[J]. 陈品三. 农药科学与管理. 2001(02)
博士论文
[1]二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物作用靶标的鉴定和验证[D]. 卢莉娜.西北农林科技大学 2015
[2]松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）对温度胁迫适应的分子生态机制研究[D]. 戴素明.湖南农业大学 2007
硕士论文
[1]根结线虫生防菌的筛选与应用研究[D]. 万景旺.中国矿业大学 2014
[2]黄瓜根结线虫病的生物防治及其生态有机药肥研制[D]. 杨文飞.南京农业大学 2011
本文编号：3384365
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
秀丽隐杆线虫细胞坏死机制（Syntichakietal2002b）
恶臭假单胞菌MCCC1A00316杀线虫物质分离鉴定和其产生的2-十一烷酮触杀线虫机制研究9图1.1秀丽隐杆线虫细胞坏死机制（Syntichakietal2002b）Fig.1.1CellnecrosismechanismofC.elegansGeng等（2012）人发现乙型感染病毒蛋白HBx直接与凋亡抑制蛋白CED-9（与人Bcl-2蛋白同源）结合，诱导秀丽隐杆线虫钙离子浓度显著升高。此外发现凋亡和坏死信号通路的的几个突变体对HBx均不敏感（死亡率比对照组低），证明了乙型感染病毒蛋白HBx可以诱导细胞凋亡和细胞坏死导致秀丽隐杆线虫死亡（图1.2）。图1.2HBx诱导秀丽隐杆线虫凋亡和坏死信号通路（Gengetal2012）Fig.1.2HBx-inducedapoptosisandnecrosispathwaysinC.elegans由于苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis）产生的晶体蛋白（crystalproteins）毒素对昆虫和线虫具有特异性的毒性，因此一直是科学界研究的热点。Zhang等（2015）发现苏云金芽胞杆菌产生的晶体蛋白Cry6Aa使秀丽隐杆线虫内钙离子浓
、肠道细胞膜破坏和出现死亡荧光等现象，这些特征与细胞坏死高度契合。Li等（2018）从中国狗牙花中分离鉴定了四个vobasinyl-ibogan类型的双吲哚生物碱，该类物质导致秀丽隐杆线虫巨噬样细胞溶酶体异常增大，其中物质HEC-23的增大效应最强。HEC-23特异性的作用于细胞中溶酶体细胞器，降低溶酶体的降解能力，死亡细胞出现累积，加剧了线虫死亡。HEC-23在哺乳动物细胞也出现类似的现象，并发现HEC-23是通过激活STAT3信号通路诱导了下游的溶酶体增大，提升了溶酶体膜的渗透性，随后引起组织蛋白酶的释放和细胞坏死（图1.3）。图1.3HEC-23诱导溶酶体增大和细胞死亡模式图（Lietal2018）Fig.1.3SchematicdiagramofHEC23-inducedlysosomalenlargementandcelldeath3.2利用“特洛伊木马”策略2010年发表在PNAS的一篇文章报道了病原细菌通过“特洛伊木马”的方式杀死线虫的机制。张克勤研究团队为了揭示细菌的杀线虫机理，首先从土壤中筛选到一株杀线虫活性较高的食线虫芽胞杆菌（Bacillusnematocida）B16，然后利用倒扣平板实验证明了B16菌株比普通的大肠杆菌对线虫更有吸引能力，分析认为B16菌株产生了挥发性的吸引物质，通过SPME-GC/MS联用技术和后续的纯品检测发现并证明了吸引线虫的挥发性物质是2-庚酮和苯甲醛等。B16菌正是借助吸引性物质吸引线虫并成功侵染到线虫体内，该细菌使用的策略与古希腊神话故事中出现的特洛伊战争中用于引诱敌人的方式很相似，因此得名“特洛伊木马”机制。作者随后通过蛋白质的基因敲除、荧光蛋白定位、异源/同源表达和显微注射等实验，确定了B16菌在进入线虫体内后会产生极强毒性的胞外蛋白酶Bace16和Bae16，这两个胞外蛋白酶作为侵染靶点和之间的协同作用在细菌对线虫的侵染过程发挥了重要的作用，破坏了线虫的肠道，?
【参考文献】：
期刊论文
[1]氨基寡糖素复配噻唑膦对柑橘线虫的防治试验[J]. 郑获,曾锦冰,李次平,叶宇平. 农业与技术. 2017(11)
[2]蔬菜根结线虫病防治技术[J]. 李晓娟. 蔬菜. 2014(01)
[3]多棘蜈蚣化学成分的研究（I）[J]. 付银丹,李振麟,濮社班,钱士辉. 中草药. 2013(13)
[4]测定生物样本中神经酰胺含量的HPLC-FLD法[J]. 娄婷婷,李英娴,方步武,刘文东,董伟林,张庆伟,薛春兰. 药物分析杂志. 2012(10)
[5]番茄根结线虫研究进展[J]. 李戌清,郑经武,郑积荣,阮松林. 浙江农业学报. 2012(04)
[6]根结线虫引起的植物根结形态与形成机理研究进展[J]. 王新荣,马超,任路路,王磊. 华中农业大学学报. 2010(02)
[7]鲁西北保护地蔬菜根结线虫病发生危害及防治措施[J]. 任爱芝,赵培宝,杜学林. 种子. 2005(10)
[8]阿维菌素类药物的研究进展[J]. 徐汉虹,梁明龙,胡林. 华南农业大学学报. 2005(01)
[9]杀线虫剂主要类型、特性及其作用机制[J]. 陈品三. 农药科学与管理. 2001(02)
博士论文
[1]二氢沉香呋喃多元酯类杀虫活性化合物作用靶标的鉴定和验证[D]. 卢莉娜.西北农林科技大学 2015
[2]松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）对温度胁迫适应的分子生态机制研究[D]. 戴素明.湖南农业大学 2007
硕士论文
[1]根结线虫生防菌的筛选与应用研究[D]. 万景旺.中国矿业大学 2014
[2]黄瓜根结线虫病的生物防治及其生态有机药肥研制[D]. 杨文飞.南京农业大学 2011
本文编号：3384365
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