产甘油假丝酵母高温诱导启动子筛选及其在木糖醇合成中的应用
发布时间：2021-09-18 12:30
发酵过程中经常出现细胞产能导致发酵温度升高,生长代谢异常,必需冷却才能正常发酵,导致能耗大。产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）作为一株优良的工业抗逆菌株,与模式菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相比,在高温下呈现明显的生长优势,具有良好的高温胁迫耐受性。启动子作为基因表达调控的重要元件,从C.glycerinogenes中筛选高温诱导启动子可为工业酵母菌株改造提供基础。本论文研究内容具体如下:根据C.glycerinogenes转录组数据结合S.cerevisiae高温胁迫相关基因的文献,从C.glycerinogenes中筛选得到了33个潜在的高温胁迫应答基因,利用荧光定量PCR技术进一步检测了这些基因在高温胁迫下基因的相对转录水平,发现CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因的转录水平在高温胁迫下上调最为明显。克隆基因对应的启动子,利用在线分析软件JASPAR数据库分析启动子序列中的高温相关转录因子结合位点,发现启动子均有高温转录因子调控特征位点。以绿色荧光蛋白基因GFP为报告基因,构建高温诱导...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
C.glycerinogenes和S.cerevisiae菌株在高温胁迫下的耐受性
nogenes菌株，完成不同细胞样品的RNA提取，并进行反转录cDNA和qRT-PCR，实时荧光定量PCR结果如图3-2所示，除了SSK2和SLN1下调外，其他基因均上调。在上调的基因中，相对转录水平大于5的有三个基因，分别是CWP1、AAC和POT1，转录水平分别上调了11、8.7和5.4倍；相对转录水平大于3的有三个基因，分别是HSP12、ATP1和INO1，转录水平分别上调了3.4、3.3和3倍；SCL转录水平上调了2.1倍；其他基因的转录水平上调较低，转录水平上调范围在1.1-2.0倍。结果表明，CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因受高温调控最显著。图3-2C.glycerinogenes高温冲击后基因转录水平Fig.3-2GeneexpressionlevelsofC.glycerinogenesaftershockedwithhightemperatureCWP1编码细胞壁蛋白相关基因，对维持细胞的形状和完整性至关重要。已有研究表明，高温胁迫下S.cerevisiae的细胞壁通过细胞壁完整性信号通路应答以高度调控和极化的方式重塑，相关的基因表达水平上调[10]。在C.glycerinogenes受到高温胁迫时，其表达水平也发生上调，表明高温胁迫时，细胞壁蛋白基因的高表达在酵母细胞中具有相似的表现。AAC和ATP1分别编码ADP，ATP转运蛋白基因和ATP合成亚基基因，催化ADP与ATP在线粒体内膜上的交换，参与ATP的合成，S.cerevisiae在高温胁迫下，参与ATP合成的相关基因表达水平上调[62,63]。在C.glycerinogenes受高温胁迫时，其表达水平发生上调，表明C.glycerinogenes遇到高温胁迫时，通过上
??幔??蠺CA循环，产生细胞新陈代谢所需的能量[69,70]。在C.glycerinogenes受到热激时，通过SCL的上调为细胞生命活动提供能量。选取CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因编码序列上游的1.5-2.0kbp氨基酸序列利用NNPPS软件2.4(neuralnetworkpromoterpredictionsoftware，http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行启动子的预测。设计PCR引物，以C.glycerinogenes基因组为模板，用上下游引物分别克隆得到PCgcwp1、PCgaac、PCgpot1、PCghsp12、PCgatp1、PCgino1和PCgscl启动子片段，琼脂糖凝胶电泳结果如图3-3所示，条带大小与理论结果相符，表明启动子克隆成功。启动子片段纯化后与pMD19-TSimpleVector质粒连接，送至天霖生物科技有限公司完成测序，经比对序列验证正确。图3-3启动子琼脂糖凝胶电泳分析M：DL2503marker；1：PCgcwp1；2：PCgaac；3：PCgpot1；4：PCghsp12；5：PCgatp1；6：PCgino1；7：PCgsclFig.3-3AgarosegelelectrophoresisofpromotersM:DL2503marker;1:PCgcwp1;2:PCgaac;3:PCgpot1;4:PCghsp12;5:PCgatp1;6:PCgino1;7:PCgscl3.1.3高温诱导启动子生物信息学分析启动子在结构上存在差异，核心启动子元件和上游增强组件的数量和位置对启动子的功能存在影响。转录因子作为控制细胞过程和对环境条件反应的调节因子，通过与启动子区域结合或者和其它转录因子形成转录因子复合体来影响基因的转录[34]。在
【参考文献】：
期刊论文
[1]啤酒酵母细胞壁环境压力应答机制研究进展[J]. 张明芳,王金晶,钮成拓,李永仙,郑飞云,刘春凤,李崎. 生物工程学报. 2019(07)
[2]ARTP诱变以及基因组重排筛选具有耐高温性能的酿酒酵母[J]. 赵宇,刘珊珊,陈叶福,郝爱丽,洪坤强,付肖蒙,王鹏飞,肖冬光. 现代食品科技. 2017(11)
[3]渗透压调控启动子表达木糖醇脱氢酶基因XYL2对重组酿酒酵母木糖代谢的影响[J]. 谷鸿宇,诸葛斌,方慧英,宗红,陆信曜,陈方林,诸葛健. 应用与环境生物学报. 2016(06)
[4]酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶通过调节细胞壁合成相关基因的表达影响细胞壁完整性[J]. 张萍,赵强,魏东盛,杨娇,朱项阳,朱旭东. 微生物学报. 2016(07)
[5]新型渗透压调控的工业酵母启动子[J]. 朱佳莉,诸葛斌,方慧英,宗红,陆信曜,张成,张炜极. 微生物学报. 2015(11)
[6]紫外诱变酿酒酵母筛选耐高温菌株[J]. 李艾,李云凯,程磊. 唐山学院学报. 2013(03)
[7]适应进化筛选耐高温产木糖醇麦芽糖假丝酵母[J]. 耿笑林,王钦宏,宋安东. 中国酿造. 2013(01)
[8]清酒酿酒酵母酒精耐受机理的研究进展[J]. 张敏,毛健,黄桂东,姬中伟,冯浩,彭金龙. 食品工业科技. 2012(20)
[9]三种酵母启动子在毕赤酵母中的功能比较[J]. 蒋慧慧,李丰功,陆毅,饶志明. 中国生物工程杂志. 2011(05)
[10]利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子[J]. 丁春生,饶志明,诸葛斌,沈微,陈献忠,方慧英,诸葛健. 微生物学报. 2008(08)
硕士论文
[1]产甘油假丝酵母己糖高效跨膜转运研究[D]. 梁展斌.江南大学 2018
[2]温度诱导酿酒酵母胞壁蛋白质的研究[D]. 谷月.大连工业大学 2015
[3]毕赤酵母AOX1启动子的阻遏因子PpMig1、PpMig2的亚细胞定位及基于RNA-Seq技术的毕赤酵母基因组重注释和比较转录组学初步研究[D]. 亓飞.华东理工大学 2014
本文编号：3400141
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
C.glycerinogenes和S.cerevisiae菌株在高温胁迫下的耐受性
nogenes菌株，完成不同细胞样品的RNA提取，并进行反转录cDNA和qRT-PCR，实时荧光定量PCR结果如图3-2所示，除了SSK2和SLN1下调外，其他基因均上调。在上调的基因中，相对转录水平大于5的有三个基因，分别是CWP1、AAC和POT1，转录水平分别上调了11、8.7和5.4倍；相对转录水平大于3的有三个基因，分别是HSP12、ATP1和INO1，转录水平分别上调了3.4、3.3和3倍；SCL转录水平上调了2.1倍；其他基因的转录水平上调较低，转录水平上调范围在1.1-2.0倍。结果表明，CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因受高温调控最显著。图3-2C.glycerinogenes高温冲击后基因转录水平Fig.3-2GeneexpressionlevelsofC.glycerinogenesaftershockedwithhightemperatureCWP1编码细胞壁蛋白相关基因，对维持细胞的形状和完整性至关重要。已有研究表明，高温胁迫下S.cerevisiae的细胞壁通过细胞壁完整性信号通路应答以高度调控和极化的方式重塑，相关的基因表达水平上调[10]。在C.glycerinogenes受到高温胁迫时，其表达水平也发生上调，表明高温胁迫时，细胞壁蛋白基因的高表达在酵母细胞中具有相似的表现。AAC和ATP1分别编码ADP，ATP转运蛋白基因和ATP合成亚基基因，催化ADP与ATP在线粒体内膜上的交换，参与ATP的合成，S.cerevisiae在高温胁迫下，参与ATP合成的相关基因表达水平上调[62,63]。在C.glycerinogenes受高温胁迫时，其表达水平发生上调，表明C.glycerinogenes遇到高温胁迫时，通过上
??幔??蠺CA循环，产生细胞新陈代谢所需的能量[69,70]。在C.glycerinogenes受到热激时，通过SCL的上调为细胞生命活动提供能量。选取CWP1、AAC、POT1、HSP12、ATP1、INO1和SCL基因编码序列上游的1.5-2.0kbp氨基酸序列利用NNPPS软件2.4(neuralnetworkpromoterpredictionsoftware，http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行启动子的预测。设计PCR引物，以C.glycerinogenes基因组为模板，用上下游引物分别克隆得到PCgcwp1、PCgaac、PCgpot1、PCghsp12、PCgatp1、PCgino1和PCgscl启动子片段，琼脂糖凝胶电泳结果如图3-3所示，条带大小与理论结果相符，表明启动子克隆成功。启动子片段纯化后与pMD19-TSimpleVector质粒连接，送至天霖生物科技有限公司完成测序，经比对序列验证正确。图3-3启动子琼脂糖凝胶电泳分析M：DL2503marker；1：PCgcwp1；2：PCgaac；3：PCgpot1；4：PCghsp12；5：PCgatp1；6：PCgino1；7：PCgsclFig.3-3AgarosegelelectrophoresisofpromotersM:DL2503marker;1:PCgcwp1;2:PCgaac;3:PCgpot1;4:PCghsp12;5:PCgatp1;6:PCgino1;7:PCgscl3.1.3高温诱导启动子生物信息学分析启动子在结构上存在差异，核心启动子元件和上游增强组件的数量和位置对启动子的功能存在影响。转录因子作为控制细胞过程和对环境条件反应的调节因子，通过与启动子区域结合或者和其它转录因子形成转录因子复合体来影响基因的转录[34]。在
【参考文献】：
期刊论文
[1]啤酒酵母细胞壁环境压力应答机制研究进展[J]. 张明芳,王金晶,钮成拓,李永仙,郑飞云,刘春凤,李崎. 生物工程学报. 2019(07)
[2]ARTP诱变以及基因组重排筛选具有耐高温性能的酿酒酵母[J]. 赵宇,刘珊珊,陈叶福,郝爱丽,洪坤强,付肖蒙,王鹏飞,肖冬光. 现代食品科技. 2017(11)
[3]渗透压调控启动子表达木糖醇脱氢酶基因XYL2对重组酿酒酵母木糖代谢的影响[J]. 谷鸿宇,诸葛斌,方慧英,宗红,陆信曜,陈方林,诸葛健. 应用与环境生物学报. 2016(06)
[4]酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶通过调节细胞壁合成相关基因的表达影响细胞壁完整性[J]. 张萍,赵强,魏东盛,杨娇,朱项阳,朱旭东. 微生物学报. 2016(07)
[5]新型渗透压调控的工业酵母启动子[J]. 朱佳莉,诸葛斌,方慧英,宗红,陆信曜,张成,张炜极. 微生物学报. 2015(11)
[6]紫外诱变酿酒酵母筛选耐高温菌株[J]. 李艾,李云凯,程磊. 唐山学院学报. 2013(03)
[7]适应进化筛选耐高温产木糖醇麦芽糖假丝酵母[J]. 耿笑林,王钦宏,宋安东. 中国酿造. 2013(01)
[8]清酒酿酒酵母酒精耐受机理的研究进展[J]. 张敏,毛健,黄桂东,姬中伟,冯浩,彭金龙. 食品工业科技. 2012(20)
[9]三种酵母启动子在毕赤酵母中的功能比较[J]. 蒋慧慧,李丰功,陆毅,饶志明. 中国生物工程杂志. 2011(05)
[10]利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子[J]. 丁春生,饶志明,诸葛斌,沈微,陈献忠,方慧英,诸葛健. 微生物学报. 2008(08)
硕士论文
[1]产甘油假丝酵母己糖高效跨膜转运研究[D]. 梁展斌.江南大学 2018
[2]温度诱导酿酒酵母胞壁蛋白质的研究[D]. 谷月.大连工业大学 2015
[3]毕赤酵母AOX1启动子的阻遏因子PpMig1、PpMig2的亚细胞定位及基于RNA-Seq技术的毕赤酵母基因组重注释和比较转录组学初步研究[D]. 亓飞.华东理工大学 2014
本文编号：3400141
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