基于两种纳米抗体的亲和标签识别体系构建及其在色谱分离中的应用
发布时间：2021-10-17 04:08
亲和色谱法作为一种基于生物分子识别原理的纯化工具,可一步纯化得到高纯度和高收率的重组蛋白。然而,对于大多数重组蛋白而言,往往难以获得合适的亲和配基。为了发展一种广谱、通用的亲和纯化技术用于重组蛋白高效纯化,本论文探索了纳米抗体的肽标签免疫识别系统作为亲和层析平台的可行性。本论文通过原核表达制备了两种能够特异性识别肽标签的纳米抗体（BC2-nb和Syn2-nb）,将两种纳米抗体通过氨基固载的方式固定在琼脂糖凝胶上,eGFP-BC2T和eGFP-EPEA为模型蛋白,考察并比较了两种纳米抗体免疫亲和柱的静态吸附性能、柱吸附和洗脱行为,同时探讨了不同pH条件和不同盐浓度对eGFP-BC2T和eGFP-EPEA吸附的影响。主要研究内容及结果如下:（1）两种纳米抗体及模式蛋白的表达纯化与亲和力测定:成功地将融合His6-tag的BC2-nb和Syn2-nb纳米抗体转化至E.coli ShuffleT7（DE3）中,并且可溶表达,目标蛋白的产量为8090 mg/L发酵液,纯度可达85%以上。eGFP-BC2T和eGFP-EPEA两种可溶的模式蛋白约占细胞破...
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 抗体药物分离纯化
1.1.1 概述
1.1.2 抗体药物的纯化过程
1.1.3 抗体纯化的一般方法
1.2 免疫亲和层析技术
1.2.1 免疫亲和层析介质
1.2.2 免疫亲和层析配基
1.2.3 亲和标签
1.2.3.1 蛋白标签
1.2.3.2 短肽标签
1.3 纳米抗体
1.3.1 纳米抗体概述
1.3.2 纳米抗体的生物学特性
1.3.3 纳米抗体的应用
1.3.4 BC2-nb和 BC2T亲和标签识别体系简介
1.3.5 Syn2-nb和 EPEA亲和标签识别体系简介
1.4 本论文研究目的、意义
2 两种纳米抗体和亲和标签识别体系的制备及活性检测
2.1 引言
2.2 实验试剂与仪器
2.2.1 材料与试剂
2.2.2 主要仪器及耗材
2.3 实验方法
2.3.1 BC2-nb和 Syn2-nb重组序列构建
2.3.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA重组序列构建
2.3.3 重组质粒的转化
2.3.4 重组蛋白的表达与纯化
2.3.5 菌体的破碎
2.3.6 SDS-PAGE电泳
2.3.7 IMAC纯化目标蛋白
2.3.8 蛋白质浓度的测定方法
2.3.9 蛋白质纯度的测定方法
2.3.10 纳米抗体亲和力测定
2.4 实验结果与分析
2.4.1 BC2-nb和 Syn2-nb的表达与纯化
2.4.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA的表达与纯化
2.4.3 纳米抗体的亲和力测定
2.5 本章小结
3 免疫吸附柱的制备和性能评价
3.1 引言
3.2 实验材料与设备
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 主要实验设备及耗材
3.3 实验方法
3.3.1 两种免疫亲和介质的制备
3.3.2 洗脱条件的优化
3.3.3 两种免疫亲和介质的动态结合载量测定
3.3.4 吸附等温线测定
3.3.5 蛋白质定量分析
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 两种免疫亲和介质的制备
3.4.2 洗脱缓冲液的优化
3.4.3 动态结合载量测定
3.4.4 等温吸附曲线的测定
3.5 本章小结
4 免疫亲和介质的实际使用效果评价
4.1 引言
4.2 实验材料与设备
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 主要仪器及耗材
4.3 实验方法
4.3.1 从细胞破碎液中一步纯化目标蛋白
4.3.2 目标蛋白精制纯化
4.3.3 两种免疫亲和介质的循环使用次数测定
4.4 实验结果与讨论
4.4.1 从细胞破碎液中一步纯化目标蛋白
4.4.2 目标蛋白精纯
4.4.3 免疫亲和柱循环使用次数
4.5 本章小结
结论
参考文献
附录A 纳米抗体及模式蛋白序列
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
本文编号：3441083
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 抗体药物分离纯化
1.1.1 概述
1.1.2 抗体药物的纯化过程
1.1.3 抗体纯化的一般方法
1.2 免疫亲和层析技术
1.2.1 免疫亲和层析介质
1.2.2 免疫亲和层析配基
1.2.3 亲和标签
1.2.3.1 蛋白标签
1.2.3.2 短肽标签
1.3 纳米抗体
1.3.1 纳米抗体概述
1.3.2 纳米抗体的生物学特性
1.3.3 纳米抗体的应用
1.3.4 BC2-nb和 BC2T亲和标签识别体系简介
1.3.5 Syn2-nb和 EPEA亲和标签识别体系简介
1.4 本论文研究目的、意义
2 两种纳米抗体和亲和标签识别体系的制备及活性检测
2.1 引言
2.2 实验试剂与仪器
2.2.1 材料与试剂
2.2.2 主要仪器及耗材
2.3 实验方法
2.3.1 BC2-nb和 Syn2-nb重组序列构建
2.3.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA重组序列构建
2.3.3 重组质粒的转化
2.3.4 重组蛋白的表达与纯化
2.3.5 菌体的破碎
2.3.6 SDS-PAGE电泳
2.3.7 IMAC纯化目标蛋白
2.3.8 蛋白质浓度的测定方法
2.3.9 蛋白质纯度的测定方法
2.3.10 纳米抗体亲和力测定
2.4 实验结果与分析
2.4.1 BC2-nb和 Syn2-nb的表达与纯化
2.4.2 e GFP-BC2T和 e GFP-EPEA的表达与纯化
2.4.3 纳米抗体的亲和力测定
2.5 本章小结
3 免疫吸附柱的制备和性能评价
3.1 引言
3.2 实验材料与设备
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 主要实验设备及耗材
3.3 实验方法
3.3.1 两种免疫亲和介质的制备
3.3.2 洗脱条件的优化
3.3.3 两种免疫亲和介质的动态结合载量测定
3.3.4 吸附等温线测定
3.3.5 蛋白质定量分析
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 两种免疫亲和介质的制备
3.4.2 洗脱缓冲液的优化
3.4.3 动态结合载量测定
3.4.4 等温吸附曲线的测定
3.5 本章小结
4 免疫亲和介质的实际使用效果评价
4.1 引言
4.2 实验材料与设备
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 主要仪器及耗材
4.3 实验方法
4.3.1 从细胞破碎液中一步纯化目标蛋白
4.3.2 目标蛋白精制纯化
4.3.3 两种免疫亲和介质的循环使用次数测定
4.4 实验结果与讨论
4.4.1 从细胞破碎液中一步纯化目标蛋白
4.4.2 目标蛋白精纯
4.4.3 免疫亲和柱循环使用次数
4.5 本章小结
结论
参考文献
附录A 纳米抗体及模式蛋白序列
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
本文编号：3441083
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3441083.html
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