过氧化物酶EfeB在大肠杆菌氧化应激中的调控作用
发布时间：2021-10-20 19:26
氧化应激（oxidative stress）是由活性氧类（reactive oxygen species,ROS）引起。ROS是生物体通过氧化代谢或由一些专一性酶类产生的一类化学活性极强的小分子物质,包括超氧化物阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）。以往关于微生物氧化应激的研究,主要关注抗氧化体系如OxyR和SoxRS转录表达调控的应激机制。但是对于微生物中过氧化物酶EfeB在氧化应激中的调控机制,尚未被阐明。本研究以大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）为研究对象,以EfeB为调控目标,通过efeB的过表达与缺失,探究外源添加H2O2和ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）对胞内氧化应激的影响以及EfeB在其中发挥的作用。主要研究内容与结果如下:（1）氧化应激条件的确立及ROS测定方法的改进。通过外源添加不同浓度的H2O2或ε-PL测得出发菌株的生长...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌的氧化应激机制Fig.1-1MechanismofoxidativestressinE.coli
第一章绪论31.3.1氧化应激调控子当细胞处于氧化应激状态时，会产生大量的ROS，此时抗氧化防御体系失衡。过度产生的ROS对细胞存在着潜在的危害，因此细菌进化出复杂的监测ROS水平并且激活相关机制的抗氧化防御基因，从而避免氧化伤害或者对损伤部位进行修复，如图1-2所示。大肠杆菌和其他细菌可以利用各种氧化剂的有害影响蛋白质中的氧化损伤作为生理信号触发全局抗氧化反应，响应ROS的调节基因分子机制由SoxR和OxyR两个最有特色的氧化还原感应引起的氧化还原应答转录因子组成[21]。两种蛋白质都可以直接将氧化信号转导至基因调控。正常状态下两种蛋白均在处于非活跃状态，只有在特定类型的氧化应激下这两种蛋白会在细胞中被短暂激活。OxyR和SoxR蛋白可以增强其产物的基因的转录，从而消除并修复ROS所带来的氧化损伤，维持细胞正常生理代谢活动[22]。图1-2细菌对氧化胁迫应答的简单机制Fig.1-2Simplemechanismofbacterialresponsetooxidativestress1.3.1.1SoxRS调控子应答转录机制SoxR在大肠杆菌中的调控机理已被广泛研究。在溶液中，SoxR是同型二聚体，每个亚基均含有[2Fe-2S]簇[23,24]，仅当[2Fe-2S]簇被氧化为[2Fe-2S]2+时，才会赋予SoxR的转录活性，进而激活soxS表达SoxR[25,26]。SoxR是大肠杆菌科的保守调节子，属于MerR家族转录调节因子，分子量为17kD[27]，是感知压力的反应信号开关，例如氧化应激，重金属或抗生素均会激活相关基因的表达，因此在氧化应激方面SoxR被确定为O2压力传感器[28,29]，经进一步的研究表明，SoxR可以通过一氧化氮以及各种内源性和异源性氧化还原剂所激活[30,31]。此外，SoxR通过鸟嘌呤自由基通过DNA介导的氧化而被激活[32]。在大肠杆菌中，SoxRS应答涉及约100个基因，其转录受SoxR通过激活
第二章材料与方法11图2-1重组质粒示意图Fig.2-1Schemeofrecombinantplasmid2.2.1.2重组菌株Eco/pEF的蛋白表达及SDS-PAGE检测（1）将构建好的重组菌株于及对照菌株于37°C、200r·min-1，摇床培养，过夜活化。（2）第二天按1%的转接量转接至50mLLB液体培养基250mL摇瓶中，重组菌株的LB液体培养基中含终浓度为50μg·mL-1Kan抗性，37°C、200r·min-1，摇床培养，第2h时加入终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG，对照菌株不添加IPTG，继续培养5h。（3）诱导结束后，8000r·min-1离心10min收集菌体，之后用PBS缓冲液洗涤菌体一次，最后用PBS缓冲液悬浮菌体，并进行超声破碎。（4）破碎后，取一定量的溶液作为全细胞破碎样品，其中出发菌株和未添加IPTG的重组菌株为空白对照样品。（5）将上述三种样品置于沸水浴中加热10min，取出样品冷却至室温后，12000r·min-1离心10min，之后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。2.2.2过氧化物酶efeB基因的敲除利用Red同源重组的原理，并参照Datsenko[68]等人的实验方法，设计实验方案进行过氧化物酶efeB基因的敲除。实验流程如下：2.2.2.1引物设计及打靶片段的扩增以E.coli的基因组为模板，设计目的基因efeB上下各500bp的同源序列的引物。分别用引物对UefeBF/UefeBR和DefeBF/DefeBR扩增出efeB上游的同源序列基因UefeB和下游的同源序列基因DefeB，并以pKD4质粒为模板设计引物kanF和kanR，扩增含有Kan抗性片段及其两端FRT基因片段。将经过限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切后的线性质粒pET22b与以上扩增出的三个基因片段利用诺唯赞ClonExpressMultiSOneStepCloningKit试剂盒进行连接，并将连接产物转化入E.coliJ感受态细胞中，将菌液涂布在Kan和Amp双抗平板上过夜培养筛选阳性转
【参考文献】：
期刊论文
[1]褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化[J]. 朱竹兵,孙亚武,唐蕾. 食品与发酵工业. 2019(13)
[2]关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控[J]. 陈丹园,沈云杰,杨燕,唐蕾. 食品与发酵工业. 2018(11)
[3]细菌产生的活性氧及其功能[J]. 刘武康,吴淑燕,陈国薇,张超,吴嫚,李森,刘箐. 微生物学杂志. 2016(01)
[4]肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株和回补株的构建[J]. 华颖,孙琦,王湘雨,杜艳丽,邵娜,张其威,赵卫,万成松. 南方医科大学学报. 2015(11)
[5]抗坏血酸对Fe2+/H2O2体系氧化NO的促进作用[J]. 赵海谦,高继慧,周伟,王忠华,吴少华. 化工学报. 2015(07)
[6]过氧化物酶和PeroxiBase过氧化物酶数据库[J]. 牛红军,岳鹍,滕文华,杨飞,杨官娥. 生命科学研究. 2012(06)
[7]转录因子SoxR的结构、调控机制及生理功能[J]. 邓名荣,朱红惠,郭俊. 微生物学报. 2010(12)
博士论文
[1]小白链霉菌同步代谢葡萄糖和甘油合成ε-聚赖氨酸的生理机制研究[D]. 曾昕.江南大学 2016
硕士论文
[1]Vc调控氧化胁迫对ε-PL发酵的影响[D]. 孙浩本.江南大学 2018
[2]链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中氧化胁迫效应及响应调控[D]. 颜鹏.江南大学 2017
本文编号：3447469
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌的氧化应激机制Fig.1-1MechanismofoxidativestressinE.coli
第一章绪论31.3.1氧化应激调控子当细胞处于氧化应激状态时，会产生大量的ROS，此时抗氧化防御体系失衡。过度产生的ROS对细胞存在着潜在的危害，因此细菌进化出复杂的监测ROS水平并且激活相关机制的抗氧化防御基因，从而避免氧化伤害或者对损伤部位进行修复，如图1-2所示。大肠杆菌和其他细菌可以利用各种氧化剂的有害影响蛋白质中的氧化损伤作为生理信号触发全局抗氧化反应，响应ROS的调节基因分子机制由SoxR和OxyR两个最有特色的氧化还原感应引起的氧化还原应答转录因子组成[21]。两种蛋白质都可以直接将氧化信号转导至基因调控。正常状态下两种蛋白均在处于非活跃状态，只有在特定类型的氧化应激下这两种蛋白会在细胞中被短暂激活。OxyR和SoxR蛋白可以增强其产物的基因的转录，从而消除并修复ROS所带来的氧化损伤，维持细胞正常生理代谢活动[22]。图1-2细菌对氧化胁迫应答的简单机制Fig.1-2Simplemechanismofbacterialresponsetooxidativestress1.3.1.1SoxRS调控子应答转录机制SoxR在大肠杆菌中的调控机理已被广泛研究。在溶液中，SoxR是同型二聚体，每个亚基均含有[2Fe-2S]簇[23,24]，仅当[2Fe-2S]簇被氧化为[2Fe-2S]2+时，才会赋予SoxR的转录活性，进而激活soxS表达SoxR[25,26]。SoxR是大肠杆菌科的保守调节子，属于MerR家族转录调节因子，分子量为17kD[27]，是感知压力的反应信号开关，例如氧化应激，重金属或抗生素均会激活相关基因的表达，因此在氧化应激方面SoxR被确定为O2压力传感器[28,29]，经进一步的研究表明，SoxR可以通过一氧化氮以及各种内源性和异源性氧化还原剂所激活[30,31]。此外，SoxR通过鸟嘌呤自由基通过DNA介导的氧化而被激活[32]。在大肠杆菌中，SoxRS应答涉及约100个基因，其转录受SoxR通过激活
第二章材料与方法11图2-1重组质粒示意图Fig.2-1Schemeofrecombinantplasmid2.2.1.2重组菌株Eco/pEF的蛋白表达及SDS-PAGE检测（1）将构建好的重组菌株于及对照菌株于37°C、200r·min-1，摇床培养，过夜活化。（2）第二天按1%的转接量转接至50mLLB液体培养基250mL摇瓶中，重组菌株的LB液体培养基中含终浓度为50μg·mL-1Kan抗性，37°C、200r·min-1，摇床培养，第2h时加入终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG，对照菌株不添加IPTG，继续培养5h。（3）诱导结束后，8000r·min-1离心10min收集菌体，之后用PBS缓冲液洗涤菌体一次，最后用PBS缓冲液悬浮菌体，并进行超声破碎。（4）破碎后，取一定量的溶液作为全细胞破碎样品，其中出发菌株和未添加IPTG的重组菌株为空白对照样品。（5）将上述三种样品置于沸水浴中加热10min，取出样品冷却至室温后，12000r·min-1离心10min，之后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。2.2.2过氧化物酶efeB基因的敲除利用Red同源重组的原理，并参照Datsenko[68]等人的实验方法，设计实验方案进行过氧化物酶efeB基因的敲除。实验流程如下：2.2.2.1引物设计及打靶片段的扩增以E.coli的基因组为模板，设计目的基因efeB上下各500bp的同源序列的引物。分别用引物对UefeBF/UefeBR和DefeBF/DefeBR扩增出efeB上游的同源序列基因UefeB和下游的同源序列基因DefeB，并以pKD4质粒为模板设计引物kanF和kanR，扩增含有Kan抗性片段及其两端FRT基因片段。将经过限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切后的线性质粒pET22b与以上扩增出的三个基因片段利用诺唯赞ClonExpressMultiSOneStepCloningKit试剂盒进行连接，并将连接产物转化入E.coliJ感受态细胞中，将菌液涂布在Kan和Amp双抗平板上过夜培养筛选阳性转
【参考文献】：
期刊论文
[1]褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化[J]. 朱竹兵,孙亚武,唐蕾. 食品与发酵工业. 2019(13)
[2]关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控[J]. 陈丹园,沈云杰,杨燕,唐蕾. 食品与发酵工业. 2018(11)
[3]细菌产生的活性氧及其功能[J]. 刘武康,吴淑燕,陈国薇,张超,吴嫚,李森,刘箐. 微生物学杂志. 2016(01)
[4]肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株和回补株的构建[J]. 华颖,孙琦,王湘雨,杜艳丽,邵娜,张其威,赵卫,万成松. 南方医科大学学报. 2015(11)
[5]抗坏血酸对Fe2+/H2O2体系氧化NO的促进作用[J]. 赵海谦,高继慧,周伟,王忠华,吴少华. 化工学报. 2015(07)
[6]过氧化物酶和PeroxiBase过氧化物酶数据库[J]. 牛红军,岳鹍,滕文华,杨飞,杨官娥. 生命科学研究. 2012(06)
[7]转录因子SoxR的结构、调控机制及生理功能[J]. 邓名荣,朱红惠,郭俊. 微生物学报. 2010(12)
博士论文
[1]小白链霉菌同步代谢葡萄糖和甘油合成ε-聚赖氨酸的生理机制研究[D]. 曾昕.江南大学 2016
硕士论文
[1]Vc调控氧化胁迫对ε-PL发酵的影响[D]. 孙浩本.江南大学 2018
[2]链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中氧化胁迫效应及响应调控[D]. 颜鹏.江南大学 2017
本文编号：3447469
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