枯草芽孢杆菌代谢调控及过程优化发酵生产七烯甲萘醌
发布时间：2021-10-30 04:15
维生素K2是人们日常饮食中必不可少的营养成分,七烯甲萘醌（Menaquinone-7,MK-7）为其重要形式。MK-7具有促进人体骨代谢和凝血因子生成的作用,可用于预防骨折和治疗维生素K缺乏导致的出血性疾病。目前,工业上合成MK-7的方法主要是化学合成法,但该方法需要额外进行分选纯化才能得到具有生物活性MK-7形式,生产成本高。利用微生物发酵法可以直接得到具有生物活性的MK-7,与化工合成法相比降低了污染,减少了工艺流程。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为革兰氏阳性模式微生物,其遗传背景清晰,基因改造方法成熟。在前期研究中,本实验室对野生型菌株Bacillus subtilis 168的胞内代谢途径进行了模块化改造并构建出一株高产MK-7的重组菌株BS21,摇瓶发酵实验的MK-7的产量达244 mg·L-1,同时发现BS21中甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（Methylerythritol-4-phosphate pathway,MEP pathway）可能是MK-7合成的限速步骤。MEP途径是枯草芽孢杆菌合成MK-7侧链结构...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
七烯甲萘醌化学结构式Fig.1-1StructureofMenaquinone-7
江南大学硕士学位论文6图1-2枯草芽孢杆菌胞内MK-7合成途径Fig.1-2ThepathwayofMK-7biosynthesisinB.subtilis1.3.2.1七烯甲萘醌侧链结构的合成甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（Methylerythritol-4-phosphatepathway，MEPpathway）也被称为非甲羟戊酸途径。该途径存在于大多数细菌，部分真核寄生虫和植物细胞的质体中，是细菌中合成MK-7侧链结构异戊二烯单元的唯一途径。国内外学者发现MEP途径对萜类化合物的生物合成有重要影响，如：半萜(异戊二烯和异戊烯醇)、单萜(柠檬烯)、倍半萜(法尼烯)、二萜(紫杉二烯)、类胡萝卜素、泛醌和甲萘醌等[71,72]。在枯草芽孢杆菌中，MEP途径（图1-2）以3-磷酸甘油醛（G3P）与丙酮酸（PYR）为底物，经过七步酶催化反应得到异戊二烯基二磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）。首先，丙酮酸与3-磷酸甘油醛在1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合成酶（Dxs）的催化下缩合生成1-脱氧-D-木糖-5-磷酸（DXP）；随后DXP被羟酸还原异构酶（Dxr）转化为2-C-甲基-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP），过程消耗一分子的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。MEP可由2-C-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶（IspD）催化形成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖（CDME），经过磷酸化和环化作用后形成2-C-甲基赤藓醇-2，4-环焦磷酸（MEcPP）。MEcPP在4-羟基-3-甲基丁烯-2-烯基二磷酸合酶（IspG）催化作用下转变
江南大学硕士学位论文18图2-1构建重组菌株流程图Fig.2-1Theflowchartofconstructingrecombinantstrains本文将枯草芽孢杆菌MEP中基因的原始启动子替换为组成型启动子P556的操作流程为：在重组BS21DF基础上将ispH基因原始启动子替换为组成型启动子P556得到重组菌株BS21DF5H。在重组BS21DFH基础上将ispE和ispG基因原始启动子替换为组成型启动子P556得到重组菌株BS21DFH5E和BS21DFH5G。在重组BS21DF5E基础上将ispH基因原始启动子替换为组成型启动子P556得到重组菌株BS21DF5E5H。重组菌株构建具体步骤：利用Spizizen转化法制作感受态枯草杆菌细胞，将按照本文2.2.2中叙述的敲除框片段构建方法融合得到完整的目的基因敲除框DNA片段转入感受态枯草杆菌细胞。于表达框中P43组成型启动子前的序列中选取一段DNA序列作为验证融合基因表达框是否整合至基因组目标位点的上游引物，命名为43.VF；分别于ispD、ispE、ispF、ispG和ispH基因编码序列中选取一段合适的DNA序列作为验证融合基因表达框是否整合至基因组目标位点的下游引物，命名为43D.VR、43E.VR、43F.VR、43G.VR和43H.VR。将引物43.VF与VR引物分别配对对抗性平板长出的重组菌株进行单菌落PCR验证，得到的DNA片段送由金唯智公司进行测序，片段测序确认正确后将PDG148质粒转化入阳性转化子内，促进lox71和lox66的重组，将抗性标记盒去除。最后，50℃孵育12h，胞内温敏性质粒PDG148丢失，将菌种保存于-80℃冰箱中备用。2.3.3重组菌株摇瓶发酵实验取保存于-80℃冰箱中的保菌管，将菌种划线于含LB固体培养基的培养皿，在37℃恒温培养箱中过夜培养。次日从培养皿中挑取一环重组菌株，接种至含3mL液体LB培养基的15mL试管中以220rpm的速度振荡培养8h作为发酵种子液。每个250mL的
【参考文献】：
期刊论文
[1]产Surfactin芽孢杆菌的筛选及特性研究[J]. 李彦林,张蔚,李晓玉,鲁心怡,曹钰. 食品与发酵工业. 2019(13)
[2]枯草杆菌发酵生产VK2的技术工艺条件初探[J]. 李拖平,郭梅,王娜,陈积星. 食品科学. 2008(11)
[3]维生素K2在治疗绝经后骨质疏松症中的作用[J]. 罗晓茹. 国外医学.药学分册. 2006(05)
[4]hprK基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响[J]. 张帆,宋辉,班睿. 生物工程学报. 2006(04)
[5]维生素K2的研究进展[J]. 邹志强. 中国骨质疏松杂志. 2005(03)
[6]维生素K生产工艺进展[J]. 张华峰,张华强,陈天华,仪宏,魏弟,秦乐乐. 饲料工业. 2004(01)
本文编号：3466029
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
七烯甲萘醌化学结构式Fig.1-1StructureofMenaquinone-7
江南大学硕士学位论文6图1-2枯草芽孢杆菌胞内MK-7合成途径Fig.1-2ThepathwayofMK-7biosynthesisinB.subtilis1.3.2.1七烯甲萘醌侧链结构的合成甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（Methylerythritol-4-phosphatepathway，MEPpathway）也被称为非甲羟戊酸途径。该途径存在于大多数细菌，部分真核寄生虫和植物细胞的质体中，是细菌中合成MK-7侧链结构异戊二烯单元的唯一途径。国内外学者发现MEP途径对萜类化合物的生物合成有重要影响，如：半萜(异戊二烯和异戊烯醇)、单萜(柠檬烯)、倍半萜(法尼烯)、二萜(紫杉二烯)、类胡萝卜素、泛醌和甲萘醌等[71,72]。在枯草芽孢杆菌中，MEP途径（图1-2）以3-磷酸甘油醛（G3P）与丙酮酸（PYR）为底物，经过七步酶催化反应得到异戊二烯基二磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）。首先，丙酮酸与3-磷酸甘油醛在1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合成酶（Dxs）的催化下缩合生成1-脱氧-D-木糖-5-磷酸（DXP）；随后DXP被羟酸还原异构酶（Dxr）转化为2-C-甲基-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP），过程消耗一分子的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。MEP可由2-C-甲基赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶（IspD）催化形成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖（CDME），经过磷酸化和环化作用后形成2-C-甲基赤藓醇-2，4-环焦磷酸（MEcPP）。MEcPP在4-羟基-3-甲基丁烯-2-烯基二磷酸合酶（IspG）催化作用下转变
江南大学硕士学位论文18图2-1构建重组菌株流程图Fig.2-1Theflowchartofconstructingrecombinantstrains本文将枯草芽孢杆菌MEP中基因的原始启动子替换为组成型启动子P556的操作流程为：在重组BS21DF基础上将ispH基因原始启动子替换为组成型启动子P556得到重组菌株BS21DF5H。在重组BS21DFH基础上将ispE和ispG基因原始启动子替换为组成型启动子P556得到重组菌株BS21DFH5E和BS21DFH5G。在重组BS21DF5E基础上将ispH基因原始启动子替换为组成型启动子P556得到重组菌株BS21DF5E5H。重组菌株构建具体步骤：利用Spizizen转化法制作感受态枯草杆菌细胞，将按照本文2.2.2中叙述的敲除框片段构建方法融合得到完整的目的基因敲除框DNA片段转入感受态枯草杆菌细胞。于表达框中P43组成型启动子前的序列中选取一段DNA序列作为验证融合基因表达框是否整合至基因组目标位点的上游引物，命名为43.VF；分别于ispD、ispE、ispF、ispG和ispH基因编码序列中选取一段合适的DNA序列作为验证融合基因表达框是否整合至基因组目标位点的下游引物，命名为43D.VR、43E.VR、43F.VR、43G.VR和43H.VR。将引物43.VF与VR引物分别配对对抗性平板长出的重组菌株进行单菌落PCR验证，得到的DNA片段送由金唯智公司进行测序，片段测序确认正确后将PDG148质粒转化入阳性转化子内，促进lox71和lox66的重组，将抗性标记盒去除。最后，50℃孵育12h，胞内温敏性质粒PDG148丢失，将菌种保存于-80℃冰箱中备用。2.3.3重组菌株摇瓶发酵实验取保存于-80℃冰箱中的保菌管，将菌种划线于含LB固体培养基的培养皿，在37℃恒温培养箱中过夜培养。次日从培养皿中挑取一环重组菌株，接种至含3mL液体LB培养基的15mL试管中以220rpm的速度振荡培养8h作为发酵种子液。每个250mL的
【参考文献】：
期刊论文
[1]产Surfactin芽孢杆菌的筛选及特性研究[J]. 李彦林,张蔚,李晓玉,鲁心怡,曹钰. 食品与发酵工业. 2019(13)
[2]枯草杆菌发酵生产VK2的技术工艺条件初探[J]. 李拖平,郭梅,王娜,陈积星. 食品科学. 2008(11)
[3]维生素K2在治疗绝经后骨质疏松症中的作用[J]. 罗晓茹. 国外医学.药学分册. 2006(05)
[4]hprK基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响[J]. 张帆,宋辉,班睿. 生物工程学报. 2006(04)
[5]维生素K2的研究进展[J]. 邹志强. 中国骨质疏松杂志. 2005(03)
[6]维生素K生产工艺进展[J]. 张华峰,张华强,陈天华,仪宏,魏弟,秦乐乐. 饲料工业. 2004(01)
本文编号：3466029
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