Bifidobacterium adolescentis蔗糖磷酸化酶的重组表达、应用及固定化研究
发布时间：2021-10-31 17:08
蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,简称SPase）作为一种葡萄糖基转移酶,能够以蔗糖为供体、葡萄糖为受体,通过转苷反应制备曲二糖。曲二糖具有促进肠道益生菌生长、抑制α-葡萄糖苷酶活性及延缓碳水化合物消化吸收等功能,在食品和医药领域具有广泛应用潜力,通常采取SPase等合成曲二糖。然而,目前报道的SPase仅在大肠杆菌中异源表达,并不适用于食品工业应用,而枯草芽孢杆菌（B.subtilis）作为食品安全宿主则是表达SPase的更佳选择。本研究首次将青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）来源的蔗糖磷酸化酶在B.subtilis WS11中异源表达,研究了SPase作为一种天然胞内酶却被分泌至胞外的原因,并对其酶学性质进行研究。在此基础上,优化重组酶制备曲二糖的工艺。此外,采用多种固定化载体对SPase进行固定化,获得了较好的固定化效果。主要研究结果如下:（1）构建重组菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase和B.subtilis/pHY300PLK-SPase,其中重组菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase摇瓶...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
曲二糖结构式Fig.1-1Structuresofkojibiose
(a) (b)图 1-2 蔗糖磷酸化酶的晶体结构(a): 蔗糖磷酸化酶结构域；(b): 蔗糖磷酸化酶活性位点Fig. 1-2 Crystal structure of sucrose phosphorylase(a): the domains of sucrose phosphorylase; (b): the active site of sucrose phosphorylase其中，A 结构域(1-85、167-291 和 356-435 位残基)是存在于 GH13 家族的典型结构β/ɑ)8桶结构，由 8 个相互平行的 ɑ-螺旋和 β-折叠组成，含此结构的酶的特性之一在于接螺旋到折叠的 loops 的平均长度要比连接折叠到螺旋的 loops 短。B 结构域(86-166残基)：主要是两个短的 ɑ-螺旋和两个反向平行的 β-折叠。B’结构域(292-355 位残基)要是盘绕区域，包含一个长 ɑ-螺旋和一个短 ɑ-螺旋，这种拓扑结构的存在，不利于寡的结合，同时减少了底物结合的通道，因此这个结构域在调节酶功能上有重要意义。 结构域：C 端的前 56 个氨基酸残基构成一个五股反向平行的 β-折叠，这是 GH13 家其他成员中未发现的结构域。尽管完整的序列含有 2 个半胱氨酸(Cys)残基，但并未在结构中发现二硫键，这是由于其中一个 Cys356 残基位于蛋白结构的表面，且被氧化砜，而另一个 Cys205 残基位于酶内部。二聚体的形成主要是两个 B 结构域的相互作
图 1-3 蔗糖磷酸化酶催化机理Fig. 1-3 Catalytic mechanism of sucrose phosphorylase磷酸化酶的催化机理如图 1-3 所示，具体如下：ase 作用底物的相关活性位点，如上图(A)所示；当蔗糖进入活性中心时，其葡即被 Glu232 质子化，同时，Aspl92 亲核进攻葡萄糖基的异头碳原子(B)；然-酶中间体，并释放果糖(C)；随后 loop A(336-344 位残基)上的果糖结合位 移出，并由磷酸盐结合位点 Tyr344 取而代之，且 loop B(130-140)上的磷酸盐Arg135 进入活性部位，使得蔗糖-酶中间体与磷酸盐(HPO42-或 H2PO4-)反应，萄糖(D)；与相应受体结合产生目的产物(E)。SPase 能可逆的催化蔗糖和磷酸糖和 D-葡萄糖-1-P。糖磷酸化酶的来源及应用蔗糖磷酸化酶的来源磷酸化酶主要分布在细菌等微生物中，目前已经报道的来源有：肠膜明串珠ostoc mesenteroides)[23-25]、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)[26, 27]、青春双歧obacterium adolescentis，简称 B. adolescentis)[28]、巨大芽孢杆菌(Bac
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酸棒杆菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表达及固定化[J]. 曹慧萍,郑璞,唐云平,徐志南. 食品与生物技术学报. 2016(08)
[2]酶法生产低聚异麦芽糖及酵母分离纯化研究[J]. 孙鲁,崔静,罗希韬,邱学良,周娟. 中国食品添加剂. 2016(03)
[3]蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及优化[J]. 叶慧,冯凤琴,莫征杰. 食品科技. 2015(04)
[4]头孢菌素脱乙酰酶的重组表达及固定化[J]. 王群,魏东芝,沈亚领,陈鑫,金雄熊,叶凤起. 工业微生物. 2014(04)
[5]食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展[J]. 王金斌,陈大超,李文,蒋玮,李鹏,张倩倩,唐雪明. 上海农业学报. 2014(01)
[6]海藻酸钠固定化α-淀粉酶的研究[J]. 郑璐,雷明科,张瑞,吴元欣. 湖北农业科学. 2013(23)
[7]重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷[J]. 万月佳,马江锋,徐蓉,贺爱永,姜岷,陈可泉,姜引. 生物工程学报. 2012(12)
[8]发酵法提纯大豆糖蜜中低聚糖的菌株筛选[J]. 赵华,段盛林,何聪芬,王领,宋杰,王雪,陈志蓉. 科技导报. 2011(19)
[9]蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究[J]. 侯顾伟,马江锋,隋姗姗,徐冰,刘嵘明,姜岷. 生物技术通报. 2011(06)
[10]巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶的分离鉴定[J]. 李群良,张欣英,姚评佳,魏远安. 化学与生物工程. 2010(12)
博士论文
[1]枯草芽孢杆菌高效表达系统构建及饲用酶制剂的开发研究[D]. 潘兴亮.中国农业科学院 2016
[2]枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径底物特性及非经典分泌途径的研究[D]. 王光强.江南大学 2013
[3]枯草芽孢杆菌食品级表达系统的构建和分泌表达研究[D]. 夏雨.江南大学 2007
硕士论文
[1]酶法转化合成α-熊果苷的研究[D]. 张文蕾.江南大学 2017
[2]长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化[D]. 叶慧.浙江大学 2015
[3]脂肪酶固定化及其在催化合成乙酸香茅酯中的应用研究[D]. 候丽云.扬州大学 2013
[4]蔗糖磷酸化酶的克隆表达及固定化[D]. 张奥.杭州师范大学 2013
[5]固定化纤维素酶的制备及其性质研究[D]. 郭锐.天津大学 2009
本文编号：3468523
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
曲二糖结构式Fig.1-1Structuresofkojibiose
(a) (b)图 1-2 蔗糖磷酸化酶的晶体结构(a): 蔗糖磷酸化酶结构域；(b): 蔗糖磷酸化酶活性位点Fig. 1-2 Crystal structure of sucrose phosphorylase(a): the domains of sucrose phosphorylase; (b): the active site of sucrose phosphorylase其中，A 结构域(1-85、167-291 和 356-435 位残基)是存在于 GH13 家族的典型结构β/ɑ)8桶结构，由 8 个相互平行的 ɑ-螺旋和 β-折叠组成，含此结构的酶的特性之一在于接螺旋到折叠的 loops 的平均长度要比连接折叠到螺旋的 loops 短。B 结构域(86-166残基)：主要是两个短的 ɑ-螺旋和两个反向平行的 β-折叠。B’结构域(292-355 位残基)要是盘绕区域，包含一个长 ɑ-螺旋和一个短 ɑ-螺旋，这种拓扑结构的存在，不利于寡的结合，同时减少了底物结合的通道，因此这个结构域在调节酶功能上有重要意义。 结构域：C 端的前 56 个氨基酸残基构成一个五股反向平行的 β-折叠，这是 GH13 家其他成员中未发现的结构域。尽管完整的序列含有 2 个半胱氨酸(Cys)残基，但并未在结构中发现二硫键，这是由于其中一个 Cys356 残基位于蛋白结构的表面，且被氧化砜，而另一个 Cys205 残基位于酶内部。二聚体的形成主要是两个 B 结构域的相互作
图 1-3 蔗糖磷酸化酶催化机理Fig. 1-3 Catalytic mechanism of sucrose phosphorylase磷酸化酶的催化机理如图 1-3 所示，具体如下：ase 作用底物的相关活性位点，如上图(A)所示；当蔗糖进入活性中心时，其葡即被 Glu232 质子化，同时，Aspl92 亲核进攻葡萄糖基的异头碳原子(B)；然-酶中间体，并释放果糖(C)；随后 loop A(336-344 位残基)上的果糖结合位 移出，并由磷酸盐结合位点 Tyr344 取而代之，且 loop B(130-140)上的磷酸盐Arg135 进入活性部位，使得蔗糖-酶中间体与磷酸盐(HPO42-或 H2PO4-)反应，萄糖(D)；与相应受体结合产生目的产物(E)。SPase 能可逆的催化蔗糖和磷酸糖和 D-葡萄糖-1-P。糖磷酸化酶的来源及应用蔗糖磷酸化酶的来源磷酸化酶主要分布在细菌等微生物中，目前已经报道的来源有：肠膜明串珠ostoc mesenteroides)[23-25]、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)[26, 27]、青春双歧obacterium adolescentis，简称 B. adolescentis)[28]、巨大芽孢杆菌(Bac
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酸棒杆菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表达及固定化[J]. 曹慧萍,郑璞,唐云平,徐志南. 食品与生物技术学报. 2016(08)
[2]酶法生产低聚异麦芽糖及酵母分离纯化研究[J]. 孙鲁,崔静,罗希韬,邱学良,周娟. 中国食品添加剂. 2016(03)
[3]蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及优化[J]. 叶慧,冯凤琴,莫征杰. 食品科技. 2015(04)
[4]头孢菌素脱乙酰酶的重组表达及固定化[J]. 王群,魏东芝,沈亚领,陈鑫,金雄熊,叶凤起. 工业微生物. 2014(04)
[5]食品级枯草芽孢杆菌表达系统的最新研究进展[J]. 王金斌,陈大超,李文,蒋玮,李鹏,张倩倩,唐雪明. 上海农业学报. 2014(01)
[6]海藻酸钠固定化α-淀粉酶的研究[J]. 郑璐,雷明科,张瑞,吴元欣. 湖北农业科学. 2013(23)
[7]重组大肠杆菌产蔗糖磷酸化酶的酶学性质及其催化合成α-熊果苷[J]. 万月佳,马江锋,徐蓉,贺爱永,姜岷,陈可泉,姜引. 生物工程学报. 2012(12)
[8]发酵法提纯大豆糖蜜中低聚糖的菌株筛选[J]. 赵华,段盛林,何聪芬,王领,宋杰,王雪,陈志蓉. 科技导报. 2011(19)
[9]蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究[J]. 侯顾伟,马江锋,隋姗姗,徐冰,刘嵘明,姜岷. 生物技术通报. 2011(06)
[10]巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶的分离鉴定[J]. 李群良,张欣英,姚评佳,魏远安. 化学与生物工程. 2010(12)
博士论文
[1]枯草芽孢杆菌高效表达系统构建及饲用酶制剂的开发研究[D]. 潘兴亮.中国农业科学院 2016
[2]枯草芽孢杆菌中Sec分泌途径底物特性及非经典分泌途径的研究[D]. 王光强.江南大学 2013
[3]枯草芽孢杆菌食品级表达系统的构建和分泌表达研究[D]. 夏雨.江南大学 2007
硕士论文
[1]酶法转化合成α-熊果苷的研究[D]. 张文蕾.江南大学 2017
[2]长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化[D]. 叶慧.浙江大学 2015
[3]脂肪酶固定化及其在催化合成乙酸香茅酯中的应用研究[D]. 候丽云.扬州大学 2013
[4]蔗糖磷酸化酶的克隆表达及固定化[D]. 张奥.杭州师范大学 2013
[5]固定化纤维素酶的制备及其性质研究[D]. 郭锐.天津大学 2009
本文编号：3468523
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