基于半理性设计的腈水合酶底物选择性及热稳定性的改造
发布时间：2021-12-17 06:57
腈水合酶（NHase,EC 4.2.1.84）是一种存在于原核和真核生物中的金属酶,能够催化腈类生成相应的酰胺类产物,而酰胺类产物作为重要的化工原料和有机合成中间体,在大宗化学品生产及医药领域有着广泛的应用。相较于传统的化学催化剂,腈水合酶转化腈类体现出一定的优势,反应条件温和且反应过程中无副产物产生。尽管如此,现阶段已报导的NHase大多底物谱较窄,选择性较差,难以定向高效地合成目标产物;此外,腈水合酶所催化的腈类水合反应为放热反应,而该酶热稳定性往往较差,以上这些因素限制了腈水合酶在更广范围内的应用。本文通过半理性设计,基于生物信息学与蛋白质工程,改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物以及外消旋腈类底物的区域选择性和对映选择性,并通过基因融合技术,提高了腈水合酶的热稳定性,主要研究结果如下:（1）基于序列比对,通过定点突变改变了腈水合酶对于多氰基腈类底物的区域选择性。以恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668来源的腈水合酶（PpNHase）和睾丸酮丛毛单胞菌Comomonas testosteroni来源的腈水合酶（CtNHase）为对象,研究两者对二氰基底...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
微生物体内腈类代谢的主要途径Fig.1-1Nitrilehydrolysispathwayinmicrobes
1.2.1 腈水合酶的分布腈水合酶（Nitrile hydratase，简称NHase）是一类能够催化腈类化合物中的氰基通过水合作用生成对应的酰胺类化合物的金属酶（图1-2）[12-15]。目前，腈水合酶在自然界中主要存在于细菌等原核生物体内，变形菌、放线菌、蓝藻及厚壁菌等菌属内都发现有腈水合酶[16]。携有腈水合酶的菌种一般是通过以腈类化合物为单一碳氮源的选择性培养基筛选得到的[17, 18]。然而，传统的选择性培养基筛选方法往往耗时费力，周期较长[19]。随着基因挖掘技术的发展，一些研究组将GenBank基因库中被注释的潜在腈水合酶基因进行了表达与性质测定，比如Xiaolin Pei等人通过将铁型腈水合酶中铁离子结合位点碱基序列与GenBank基因库中所有可能的腈水合酶基因序列进行比对，筛选得到了一种全新的铁型腈水合酶基因[20]。腈水合酶先前被认为只存在于原核生物中，直到研究人员首次在一种海洋真核生物领鞭毛虫Monosiga brevicollis中发现了腈水合酶的存在[21]。据推测
第一章 绪论3钴型腈水合酶活性中心配位的是三价低自旋的非咕啉钴（图1-3）[23-26]。除了这两种主要的金属离子，腈水合酶活性中心还被发现能够结合其他的金属离子，来源于红球菌Rhodococcus jostii的腈水合酶活性中心可以结合铜、钴及锌三种不同的金属[27]。此外，一种地中海海绵Aplysina cavernicola来源的腈水合酶的活性并不严格依赖铁或钴离子的摄入，镁离子也能在一定程度上激活这一来源的腈水合酶[28]。根据蛋白质结构数据库Protein Data Bank（PDB）已报导的腈水合酶晶体结构，腈水合酶的活性中心成爪状结构，金属离子与腈水合酶活性中心三个半胱氨酸残基上的硫原子及肽链骨架上的两个酰胺氮原子配位，爪状结构正上方由一个一氧化氮分子（铁型腈水合酶）（图1-3a）或一个水分子（钴型腈水合酶）（图1-3b）占据[29-31]。腈水合酶活性中心结合的金属离子不仅能够帮助促进底物的水合，还能起到稳定腈水合酶构象的作用[32]。铁型腈水合酶主要存在于红平红球菌Rhodococcus erythropolis中
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rhodococcus ruber CGMCC3090腈水合酶纯化、酶学性质及结晶研究[J]. 王世伟,王敏,王卿惠. 中国生物工程杂志. 2017(10)
[2]恶臭假单胞菌腈水合酶βAla97影响催化己二腈的区域选择性[J]. 张君,崔文璟,刘义,崔幼恬,周哲敏. 生物加工过程. 2015(03)
[3]酶促反应的“诱导契合-锁钥”模式[J]. 张子剑,潘荣,周园,赫荣乔. 生物化学与生物物理进展. 2011(05)
[4]腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展[J]. 马武生,马同森,杨生玉. 化学研究. 2004(01)
[5]微生物法生产丙烯酰胺的生物催化剂——腈水合酶研究进展[J]. 刘铭,焦鹏,曹竹安. 化工学报. 2001(10)
本文编号：3539604
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
微生物体内腈类代谢的主要途径Fig.1-1Nitrilehydrolysispathwayinmicrobes
1.2.1 腈水合酶的分布腈水合酶（Nitrile hydratase，简称NHase）是一类能够催化腈类化合物中的氰基通过水合作用生成对应的酰胺类化合物的金属酶（图1-2）[12-15]。目前，腈水合酶在自然界中主要存在于细菌等原核生物体内，变形菌、放线菌、蓝藻及厚壁菌等菌属内都发现有腈水合酶[16]。携有腈水合酶的菌种一般是通过以腈类化合物为单一碳氮源的选择性培养基筛选得到的[17, 18]。然而，传统的选择性培养基筛选方法往往耗时费力，周期较长[19]。随着基因挖掘技术的发展，一些研究组将GenBank基因库中被注释的潜在腈水合酶基因进行了表达与性质测定，比如Xiaolin Pei等人通过将铁型腈水合酶中铁离子结合位点碱基序列与GenBank基因库中所有可能的腈水合酶基因序列进行比对，筛选得到了一种全新的铁型腈水合酶基因[20]。腈水合酶先前被认为只存在于原核生物中，直到研究人员首次在一种海洋真核生物领鞭毛虫Monosiga brevicollis中发现了腈水合酶的存在[21]。据推测
第一章 绪论3钴型腈水合酶活性中心配位的是三价低自旋的非咕啉钴（图1-3）[23-26]。除了这两种主要的金属离子，腈水合酶活性中心还被发现能够结合其他的金属离子，来源于红球菌Rhodococcus jostii的腈水合酶活性中心可以结合铜、钴及锌三种不同的金属[27]。此外，一种地中海海绵Aplysina cavernicola来源的腈水合酶的活性并不严格依赖铁或钴离子的摄入，镁离子也能在一定程度上激活这一来源的腈水合酶[28]。根据蛋白质结构数据库Protein Data Bank（PDB）已报导的腈水合酶晶体结构，腈水合酶的活性中心成爪状结构，金属离子与腈水合酶活性中心三个半胱氨酸残基上的硫原子及肽链骨架上的两个酰胺氮原子配位，爪状结构正上方由一个一氧化氮分子（铁型腈水合酶）（图1-3a）或一个水分子（钴型腈水合酶）（图1-3b）占据[29-31]。腈水合酶活性中心结合的金属离子不仅能够帮助促进底物的水合，还能起到稳定腈水合酶构象的作用[32]。铁型腈水合酶主要存在于红平红球菌Rhodococcus erythropolis中
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rhodococcus ruber CGMCC3090腈水合酶纯化、酶学性质及结晶研究[J]. 王世伟,王敏,王卿惠. 中国生物工程杂志. 2017(10)
[2]恶臭假单胞菌腈水合酶βAla97影响催化己二腈的区域选择性[J]. 张君,崔文璟,刘义,崔幼恬,周哲敏. 生物加工过程. 2015(03)
[3]酶促反应的“诱导契合-锁钥”模式[J]. 张子剑,潘荣,周园,赫荣乔. 生物化学与生物物理进展. 2011(05)
[4]腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展[J]. 马武生,马同森,杨生玉. 化学研究. 2004(01)
[5]微生物法生产丙烯酰胺的生物催化剂——腈水合酶研究进展[J]. 刘铭,焦鹏,曹竹安. 化工学报. 2001(10)
本文编号：3539604
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