解脂耶氏酵母异源合成α-檀香烯的菌株构建及发酵探究

发布时间：2021-12-17 14:33

　　檀香油是来源于植物檀香的一种名贵香料,具有抗菌、美容和镇静等作用。α-檀香烯是檀香油主要成分α-檀香醇的前体物质。解脂酵母是一种公认安全的微生物,可以利用多种碳源生产萜类或生物燃料等多种高附加值产物。本文提出了一种解脂耶氏酵母异源合成α-檀香烯的方法。以解脂耶氏酵母ATCC 201249为底盘菌,将经密码子优化的植物源α-檀香烯合成酶STS整合到基因组上,双相发酵得到5.19mg/L的α-檀香烯。质粒过表达MVA途径上游系列基因 ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、HMG1和fHMG1,发现ERG8、HMG1和tHMG1可以提高FPP供给并提升产量,其余基因的优化更趋向于竞争途径鲨烯的合成。将关键基因ERG8和HMG1分别进行多拷贝优化,α-檀香烯的产量均有所提升。又分别构建和表达了单拷贝pERG8HMG1质粒和多拷贝ERG8-HMG1模块,其中单拷贝pERG8HMG1质粒过表达使α-檀香烯产量提升最明显,达到13.31mg/L。双相发酵优化中探索了正十二烷添加量、添加时间和发酵时长对产物积累的影响,在发酵6h添加10%的正十二烷,发酵5天最有利于菌体生长和产物积... 

【文章来源】：天津大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２檀香萜类化合物的结构式及合成路径［７９］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｆｏｒｍｕｌａ?ａｎｄ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｓａｎｄａｌｗｏｏｄ?ｔｅｒｐｅｎｅｓ??（关键酶：ＦＰＰＳ法尼基焦磷酸合成酶，ＳａＳ办ａ－檀香烯合酶；化合物：１?ｃｔ?－檀香烯，２ａ－ｅｘｏ－??佛手柑油烯，３ｅｐｉ－（３－檀香烯，４Ｐ－檀香烯）??

第３章解脂耶氏酵母产ａ－檀香烯的菌株构建??３．２．２外源基因５ＴＳ在解脂酵母基因组的初步表达??如图３－２所示是在解脂酵母中初步表达Ｓｒａ构建的表达模块??示意图。我们将表达模块以同源双交换的形??式整合到了解脂酵母ＳＡ菌株的多拷贝位点ｒＺ）况４位点上。??ｒ２?ＴＥＦｌｐ?ＳＴＳ?ＸＰＲ２ｔ?ｒｌ??ｒｌ?ｒｌ??ｒＤＮＡ?ｓｉｔｅ??图３－２?ｓｒａ表达模块整合示意图??Ｆｉｇ．３－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＳＴＳ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｍｏｄｕｌｅ?ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ??解脂酵母和酿酒酵母一样可以通过ＤＮＡ片段的转化、同源重组来将外源基??因自组装到自身基因组上。需要体内同源重组的片段之间需要有８０?ｂｐ左右的同??源区域。本实验使用软件〇ｌｉｇ〇７设计ＤＮＡ片段的扩增引物，以解脂耶氏酵母??（Ｆａｍｗｂ?％〇／沖＿〇？?Ｊ７ＵＣ?２Ｗ２办）的基因组为模板，扩增出启动子和??ＸＰｉ？２（终止子，以及ｒＺＷＸ位点的上下同源臂，从基因优化公司提供的ｐＵＣ５７??质粒为模板扩增出优化完成的基因。使用普通ＤＮＡ纯化试剂盒对ＰＣＲ产物??进行纯化回收，条带不单一时使用普通琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒回收片段。??其中７１设７；？长４０６５？、义烈２（长４１２匕？、灯５长１６５６匕？，”況４位点的上下同源??臂分别长为７００?ｂｐ和５９９?ｂｐ。回收完成的基因片段，将ｒｌＷＸ上臂和了五厂分、??？Ｓｒａ、三个基因体外融合成一个片段，将ｗｒｆｌ３标记基因和ｒＺＷＪ下臂融合??成一个片段并回收

将原始菌和ＳＡ－１接种到摇瓶进行双相发酵，３天后取正十二烷相检测ＳＡ－１??工程菌的外排物中是否有目标产物ａ－檀香烯的产生，正十二烷相的处理方法参照??２．２．１４。气相色谱质谱联用仪测定结果如图３－４所示，和原始菌的发酵产物相比，??ＳＡ－１的发酵样品在１０．８４１处产生一个新峰，经质谱图的与化合物质谱图库相对??比，发现该新峰就是目标产物ａ－檀香烯，ＣＡＳ号为５１２－６１－８。??ａ?ｊ／?Ｎｅｗ?ｐｅａｋ??ａ－ｈｕｍｌｅｎｅ??Ｊ？——＿＿——????＾＿＾－４??????ｉ?９．６?９７?９?６?９９?１０?１０．１?１０２?１０．３?１０?４?１０?５?１０．６?１０?７?１０．８?１０?９?１１?１１．１?１１２?１１．３?１１?４?１１．５?１１．６?１１?７?１１．８?１１９?１２?１２．１?１２２?１２．３?１２?４?１２Ｓ??４６??

【参考文献】：
期刊论文
[1]酵母胞外槐糖脂产生条件优化及其抑菌作用[J]. 陈静,宋欣,曲音波,刘爱芹.  山东大学学报(理学版). 2005(03)

博士论文
[1]代谢工程改造耶罗维解脂酵母生产β-胡萝卜素研究[D]. 尹升明.上海医药工业研究院 2017



本文编号：3540323