酸性蛋白酶的表达及其在大豆蛋白和虾壳酶解中的应用研究
发布时间：2022-01-02 01:58
酸性蛋白酶是一种存在于植物、动物、细菌、真菌和病毒等大多数生物体中的重要蛋白酶,因其以两个高度保守的天冬氨酸作为催化残基,因此又称为天冬氨酸蛋白酶。酸性蛋白酶的二级结构主要由β-折叠组成,三级结构呈高度对称的双叶构型,催化位点位于对称的裂缝之间,通过激活水分子来裂解肽键。酸性蛋白酶在皮革行业的鞣制,洗涤剂的添加剂,奶酪的制作,饮料和酒类的除浊以及水解廉价底物（如豆渣,虾壳,菌渣,菇渣,羽毛）等领域均有广泛应用。本课题从热带假丝酵母和近平滑假丝酵母中克隆了52个蛋白酶基因,构建了两种不同重组表达载体——诱导型载体p ICh和组成型载体p IC9BM-GAP,并将含有目的基因的表达载体与毕赤酵母GS115的基因组整合,成功构建了47个蛋白酶重组表达菌株。从中筛选得到两个高产酸性蛋白酶的重组菌株,其中酸性蛋白酶SAPP1的分子量大小为47 k Da,在最适反应条件pH 3.0,50℃下测的诱导型最高酶活为405.36 U/m L,组成型为113.98 U/m L,在pH 4.0-6.0和50℃以下酶活较为稳定。而酸性蛋白酶SAPT的分子量为50 k Da,最适反应条件为pH 3.0,55℃,...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
天冬氨酸酶的催化机理[15]
第二章蛋白酶的克隆及重组表达载体的构建23M12图2-1总RNA电泳图。M为DL10000DNAMarker；孔道1为近平滑假丝酵母RNA;孔道2为热带假丝酵母RNAFigure.2-1TotalRNAelectropherogram.LaneM:DL10000DNAMarker;lane1CandidaparapsilosisRNA;lane2CandidatropicalisRNA2.3.3蛋白酶基因克隆的结果以反转录后的cDNA为模板，分别用不含信号肽的蛋白酶基因设计的特异性引物进行RT-PCR扩增，其中PCR结果如图2-2所示，本研究从近平滑假丝酵母和热带假丝酵母的52个蛋白酶基因中成功克隆47个蛋白酶基因，经凝胶电泳验证目的条带大小与理论的大小一致，并且条带单一明亮，经过回收纯化后，可以用于后续的的实验。2.3.4阳性克隆验证在含Amp抗性的平板上分别随机挑选5个单菌落验证含不同目的基因的PMD-18T是否成功连接并转化至E.coliDH5α中，由于菌落PCR的结果太多，图2-3只显示了部分结果，凝胶电泳的结果表明他们为阳性克拢为了进一步验证，每个基因从阳性克隆子中挑选两个送去给生工生物测序，部分测序结果如附录Ⅳ，附录Ⅴ所示，经过序列比对，与Genblak报道的相应序列高度一致,其中相似度SAPT99.8%，SAPP199.7%。4000bp2000bp28S18S
华南理工大学硕士学位论文24图2-2RT-PCR产物。M为DL2000DNAMarker；其他孔道为RT-PCR结果.Figure.2-2ThepartiallyresultsofRT-PCR.LaneM:DL2000DNAMarker;otherlaneswereRT-PCRresults.图2-3目的基因转化至大肠杆菌的部分菌落PCR结果。M为DL10000DNAmarker；其他孔道为菌落PCR结果。Figure.2-3TheresultsofcolonyPCRthattargetgenestransformedintoE.coli.LaneM:DL10000DNAMarker;otherlaneswerecolonyPCRresults.
【参考文献】：
期刊论文
[1]米曲霉酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质[J]. 岳晓平,陈朋,朱玥明,曾艳,刘汉民,刘红彦,王敏,孙媛霞. 生物工程学报. 2019(03)
[2]毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展[J]. 武婕,张晓雪,余河水,李薇,贾宇平,郭江玉,张丽娟,宋新波. 中国生物工程杂志. 2016(01)
[3]毕赤酵母基因工程菌高密度发酵及其应用研究[J]. 刘晓明,张爱忠,姜宁,王秋菊,祁丽,解堂东. 黑龙江畜牧兽医. 2016(01)
[4]饲料中添加蛋白酶Aquagrow对鲤生长和蛋白质消化酶活性的影响[J]. 刘鼎云,冷向军,卢永红,李小勤. 淡水渔业. 2007(05)
博士论文
[1]霉菌蛋白酶基因的克隆、表达及水解特性的研究[D]. 柯野.华南理工大学 2013
[2]巴氏毕赤酵母基因工程菌高密度发酵表达重组人源胶原蛋白[D]. 刘斌.南京理工大学 2012
[3]大豆蛋白的分子修饰及特性研究[D]. 潘思轶.华中农业大学 2005
硕士论文
[1]毕赤酵母高效表达Streptomyces sp.FA1木聚糖酶基因工程菌构建及发酵优化[D]. 潘阳.江南大学 2018
本文编号：3563245
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
天冬氨酸酶的催化机理[15]
第二章蛋白酶的克隆及重组表达载体的构建23M12图2-1总RNA电泳图。M为DL10000DNAMarker；孔道1为近平滑假丝酵母RNA;孔道2为热带假丝酵母RNAFigure.2-1TotalRNAelectropherogram.LaneM:DL10000DNAMarker;lane1CandidaparapsilosisRNA;lane2CandidatropicalisRNA2.3.3蛋白酶基因克隆的结果以反转录后的cDNA为模板，分别用不含信号肽的蛋白酶基因设计的特异性引物进行RT-PCR扩增，其中PCR结果如图2-2所示，本研究从近平滑假丝酵母和热带假丝酵母的52个蛋白酶基因中成功克隆47个蛋白酶基因，经凝胶电泳验证目的条带大小与理论的大小一致，并且条带单一明亮，经过回收纯化后，可以用于后续的的实验。2.3.4阳性克隆验证在含Amp抗性的平板上分别随机挑选5个单菌落验证含不同目的基因的PMD-18T是否成功连接并转化至E.coliDH5α中，由于菌落PCR的结果太多，图2-3只显示了部分结果，凝胶电泳的结果表明他们为阳性克拢为了进一步验证，每个基因从阳性克隆子中挑选两个送去给生工生物测序，部分测序结果如附录Ⅳ，附录Ⅴ所示，经过序列比对，与Genblak报道的相应序列高度一致,其中相似度SAPT99.8%，SAPP199.7%。4000bp2000bp28S18S
华南理工大学硕士学位论文24图2-2RT-PCR产物。M为DL2000DNAMarker；其他孔道为RT-PCR结果.Figure.2-2ThepartiallyresultsofRT-PCR.LaneM:DL2000DNAMarker;otherlaneswereRT-PCRresults.图2-3目的基因转化至大肠杆菌的部分菌落PCR结果。M为DL10000DNAmarker；其他孔道为菌落PCR结果。Figure.2-3TheresultsofcolonyPCRthattargetgenestransformedintoE.coli.LaneM:DL10000DNAMarker;otherlaneswerecolonyPCRresults.
【参考文献】：
期刊论文
[1]米曲霉酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质[J]. 岳晓平,陈朋,朱玥明,曾艳,刘汉民,刘红彦,王敏,孙媛霞. 生物工程学报. 2019(03)
[2]毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展[J]. 武婕,张晓雪,余河水,李薇,贾宇平,郭江玉,张丽娟,宋新波. 中国生物工程杂志. 2016(01)
[3]毕赤酵母基因工程菌高密度发酵及其应用研究[J]. 刘晓明,张爱忠,姜宁,王秋菊,祁丽,解堂东. 黑龙江畜牧兽医. 2016(01)
[4]饲料中添加蛋白酶Aquagrow对鲤生长和蛋白质消化酶活性的影响[J]. 刘鼎云,冷向军,卢永红,李小勤. 淡水渔业. 2007(05)
博士论文
[1]霉菌蛋白酶基因的克隆、表达及水解特性的研究[D]. 柯野.华南理工大学 2013
[2]巴氏毕赤酵母基因工程菌高密度发酵表达重组人源胶原蛋白[D]. 刘斌.南京理工大学 2012
[3]大豆蛋白的分子修饰及特性研究[D]. 潘思轶.华中农业大学 2005
硕士论文
[1]毕赤酵母高效表达Streptomyces sp.FA1木聚糖酶基因工程菌构建及发酵优化[D]. 潘阳.江南大学 2018
本文编号：3563245
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3563245.html
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