重组大肠杆菌全细胞催化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸
发布时间：2022-01-02 09:26
5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid,MPCA）是重要的医药中间体,被广泛应用于降血糖药物、降血脂药物及治疗结核病药物的合成。传统的化学合成法、现有的野生菌转化法及酶催化法合成MPCA存在着环境污染,生产周期长及需要利用有毒物质二甲苯等问题,因此本研究建立了一种对环境友好的重组大肠杆菌（Escherichia coli）全细胞催化高效制备MPCA的方法。首先,为了在E.coli中构建MPCA的合成途径,克隆来源于恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）ATCC 33015编码二甲苯单加氧酶（Xylene monooxygenase,XMO）的xylM和xylA基因,编码苯甲醇脱氢酶（Benzyl alcohol dehydrogenase,BADH）的xylB基因和编码苯甲醛脱氢酶（Benzaldehyde dehydrogenase,BZDH）的xylC基因至表达载体pET28a。对菌体收集的时期、三个酶的表达量组合进行优化获得重组菌E.coli MABC1,并对其催化条件进行优化,确定最优条件为:细胞量OD
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MPCA的结构式
江南大学硕士学位论文2式，可以应用于催化剂的制备[8]。图1-2格列吡嗪的合成路线（a）阿昔莫司的合成路线（b）5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯的合成路线（c）Fig.1-2Syntheticrouteofglipizide(a)syntheticrouteofacipimox(b)syntheticrouteof5-methylpyrazine2-methylcarboxylate(c)1.2MPCA的生产方法目前主要合成MPCA的方法可以分为化学合成法、电化学合成法及生物转化法。1.2.1化学合成法化学合成法是目前合成MPCA最常用的方法，因采用不同的起始原料及不同合成路线又可对化学合成法进一步进行分类，主要分为分子间环合法、多步反应法和氧化法（图1-3）。其中分子间环合法通常以丙酮醛与二氨基马来腈或邻苯二胺为基本原料，环合生成2,3-二氰基-5-甲基吡嗪或2-甲基苯并吡嗪，后再经过一系列酸化、脱羧反应得到MPCA[9,10]。2003年，张瑞宽[10]以丙酮醛和邻苯二胺为原料开创了MPCA合成的方法，该方法具备较为简单的工艺及易控制的反应过程，被广泛应用于在工业上。多步反应法主要以2,5-二甲基吡嗪（2,5-Dimethylpyrazine，DMP）为原料在吡嗪杂环或甲基上进行一系列反应，从而合成MPCA[11-13]。2007年，陶家林等人[12]以DMP为原料，采用氧化、酰化、水解、氧化四步合成路线，最终合成的MPCA的总收率达到78%，含量≥98%，
柿柯?阕魑?揭┲屑涮宓囊?蟆５?蚨嗖椒从Ψǖ暮铣陕废呓铣ぁ⒅屑涮逡妆谎趸??收率低等问题，其工业化较难被实现。氧化法则是指以DMP为原料，在一定条件下，利用催化剂进行氧化反应生成MPCA。因不同的催化剂的选择可分为高锰酸钾直接氧化法、光催化氧化法、液相催化氧化法及气相催化氧化法[14-17]。2007年，顾豪辉等人[14]通过循环利用原料法并利用高锰酸钾直接氧化DMP，得到的MPCA的收率＞75%，纯度＞99%，达到医药中间体的要求，该法具有较广阔的应用前景。但是氧化法仍存在着催化剂有毒、产物选择性较差等问题。图1-3化学合成法的分类Fig.1-3Classificationofchemicalsynthesis1.2.2电化学合成法电化学合成法是指基于化学合成法中所获得的DMP的R基取代物，进一步电解氧化DMP的R基取代物得到目标产物MPCA。1992年，Marco等人[18]通过使用氢氧化钠及氢氧化镍酰阳极，在一定温度下对DMP的单R基取代物进行电解氧化，而后萃娶蒸馏，最终收率可达80%~90%。虽然电化学合成法避免了高温、容器易被腐蚀、环境污染大等问题，但是它带来了其他的问题如高能耗及高生产成本。1.2.3生物转化法生物转化法指采用全细胞或提取的酶作为催化剂来转化底物生成目标产物，该法被广泛应用于药物中间体、光学对映体、维生素等产品的生产中[19]。依据催化剂的种类可进一步分为全细胞催化和酶法催化。全细胞催化通过利用微生物细胞进行转化，其利用胞内的辅因子并无需进行细胞破碎，这降低了催化剂成本并提高了催化效率。全细胞催化进一步可细分为野生菌的全细胞催化和基因工程菌的全细胞催化，两者的区别在于所采用的酶是微生物本身的还是异源表达的。酶法催化则主要是通过提取并纯化酶，添加催化过程中需要的辅因子，来实现无细胞催化。不同于全细胞催化，?
【参考文献】：
期刊论文
[1]产二甲苯单加氧酶菌株的筛选、鉴定及转化2,5-二甲基吡嗪条件的优化[J]. 刘丽娟,薛亚平,郑裕国. 化学与生物工程. 2012(09)
[2]5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成[J]. 谢婷,陈文华. 化学试剂. 2011(09)
[3]生物转化—从全细胞催化到代谢工程[J]. 郭明,胡昌华. 中国生物工程杂志. 2010(04)
[4]阿昔莫司的合成[J]. 张贵民,肖月华,王洪刚,岳永力,冯晓亮. 中国医药工业杂志. 2009(10)
[5]两个含5-甲基吡嗪-2-羧酸主族配合物的合成和晶体结构[J]. 徐基贵,潘兆瑞,郑和根. 无机化学学报. 2009(09)
[6]5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成工艺改进[J]. 陈炳和,陈文华. 化学试剂. 2008(11)
[7]大肠杆菌表达系统的研究进展[J]. 解庭波. 长江大学学报(自科版)医学卷. 2008(03)
[8]一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR[J]. 李敏,杨谦. 中国生物工程杂志. 2007(08)
[9]医药中间体市场动态与发展趋势[J]. 侯仲轲. 精细化工中间体. 2006(06)
[10]Red同源重组技术研究进展[J]. 韩聪,张惟材,游松. 中国生物工程杂志. 2003(12)
硕士论文
[1]L-氨基酸脱氨酶分子改造提高α-酮异戊酸合成效率[D]. 黎若熙.江南大学 2017
[2]Sorangium cellulosum So0157-2两个内切酶的异源表达及性质分析暨MPCA生物转化法探究[D]. 杨珊珊.山东大学 2015
[3]2-甲基吡嗪-5-羧酸的合成及工艺优化[D]. 顾豪辉.天津大学 2007
本文编号：3563926
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MPCA的结构式
江南大学硕士学位论文2式，可以应用于催化剂的制备[8]。图1-2格列吡嗪的合成路线（a）阿昔莫司的合成路线（b）5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯的合成路线（c）Fig.1-2Syntheticrouteofglipizide(a)syntheticrouteofacipimox(b)syntheticrouteof5-methylpyrazine2-methylcarboxylate(c)1.2MPCA的生产方法目前主要合成MPCA的方法可以分为化学合成法、电化学合成法及生物转化法。1.2.1化学合成法化学合成法是目前合成MPCA最常用的方法，因采用不同的起始原料及不同合成路线又可对化学合成法进一步进行分类，主要分为分子间环合法、多步反应法和氧化法（图1-3）。其中分子间环合法通常以丙酮醛与二氨基马来腈或邻苯二胺为基本原料，环合生成2,3-二氰基-5-甲基吡嗪或2-甲基苯并吡嗪，后再经过一系列酸化、脱羧反应得到MPCA[9,10]。2003年，张瑞宽[10]以丙酮醛和邻苯二胺为原料开创了MPCA合成的方法，该方法具备较为简单的工艺及易控制的反应过程，被广泛应用于在工业上。多步反应法主要以2,5-二甲基吡嗪（2,5-Dimethylpyrazine，DMP）为原料在吡嗪杂环或甲基上进行一系列反应，从而合成MPCA[11-13]。2007年，陶家林等人[12]以DMP为原料，采用氧化、酰化、水解、氧化四步合成路线，最终合成的MPCA的总收率达到78%，含量≥98%，
柿柯?阕魑?揭┲屑涮宓囊?蟆５?蚨嗖椒从Ψǖ暮铣陕废呓铣ぁ⒅屑涮逡妆谎趸??收率低等问题，其工业化较难被实现。氧化法则是指以DMP为原料，在一定条件下，利用催化剂进行氧化反应生成MPCA。因不同的催化剂的选择可分为高锰酸钾直接氧化法、光催化氧化法、液相催化氧化法及气相催化氧化法[14-17]。2007年，顾豪辉等人[14]通过循环利用原料法并利用高锰酸钾直接氧化DMP，得到的MPCA的收率＞75%，纯度＞99%，达到医药中间体的要求，该法具有较广阔的应用前景。但是氧化法仍存在着催化剂有毒、产物选择性较差等问题。图1-3化学合成法的分类Fig.1-3Classificationofchemicalsynthesis1.2.2电化学合成法电化学合成法是指基于化学合成法中所获得的DMP的R基取代物，进一步电解氧化DMP的R基取代物得到目标产物MPCA。1992年，Marco等人[18]通过使用氢氧化钠及氢氧化镍酰阳极，在一定温度下对DMP的单R基取代物进行电解氧化，而后萃娶蒸馏，最终收率可达80%~90%。虽然电化学合成法避免了高温、容器易被腐蚀、环境污染大等问题，但是它带来了其他的问题如高能耗及高生产成本。1.2.3生物转化法生物转化法指采用全细胞或提取的酶作为催化剂来转化底物生成目标产物，该法被广泛应用于药物中间体、光学对映体、维生素等产品的生产中[19]。依据催化剂的种类可进一步分为全细胞催化和酶法催化。全细胞催化通过利用微生物细胞进行转化，其利用胞内的辅因子并无需进行细胞破碎，这降低了催化剂成本并提高了催化效率。全细胞催化进一步可细分为野生菌的全细胞催化和基因工程菌的全细胞催化，两者的区别在于所采用的酶是微生物本身的还是异源表达的。酶法催化则主要是通过提取并纯化酶，添加催化过程中需要的辅因子，来实现无细胞催化。不同于全细胞催化，?
【参考文献】：
期刊论文
[1]产二甲苯单加氧酶菌株的筛选、鉴定及转化2,5-二甲基吡嗪条件的优化[J]. 刘丽娟,薛亚平,郑裕国. 化学与生物工程. 2012(09)
[2]5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成[J]. 谢婷,陈文华. 化学试剂. 2011(09)
[3]生物转化—从全细胞催化到代谢工程[J]. 郭明,胡昌华. 中国生物工程杂志. 2010(04)
[4]阿昔莫司的合成[J]. 张贵民,肖月华,王洪刚,岳永力,冯晓亮. 中国医药工业杂志. 2009(10)
[5]两个含5-甲基吡嗪-2-羧酸主族配合物的合成和晶体结构[J]. 徐基贵,潘兆瑞,郑和根. 无机化学学报. 2009(09)
[6]5-甲基吡嗪-2-羧酸的合成工艺改进[J]. 陈炳和,陈文华. 化学试剂. 2008(11)
[7]大肠杆菌表达系统的研究进展[J]. 解庭波. 长江大学学报(自科版)医学卷. 2008(03)
[8]一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR[J]. 李敏,杨谦. 中国生物工程杂志. 2007(08)
[9]医药中间体市场动态与发展趋势[J]. 侯仲轲. 精细化工中间体. 2006(06)
[10]Red同源重组技术研究进展[J]. 韩聪,张惟材,游松. 中国生物工程杂志. 2003(12)
硕士论文
[1]L-氨基酸脱氨酶分子改造提高α-酮异戊酸合成效率[D]. 黎若熙.江南大学 2017
[2]Sorangium cellulosum So0157-2两个内切酶的异源表达及性质分析暨MPCA生物转化法探究[D]. 杨珊珊.山东大学 2015
[3]2-甲基吡嗪-5-羧酸的合成及工艺优化[D]. 顾豪辉.天津大学 2007
本文编号：3563926
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