利用甘油生产L—丝氨酸重组大肠杆菌的构建
发布时间：2022-01-25 14:24
随着生物柴油制造业的持续发展,其副产物甘油的量也大幅度的增加,如何利用甘油生产高附加值的产品成为研究的热点。L-丝氨酸属于非必需氨基酸,在医药、化妆品等领域有着广泛的应用。如果将过剩的甘油转化成市场需求量大的L-丝氨酸,将会实现资源充分利用,且在一定程度上降低L-丝氨酸的生产成本。本论文以野生型大肠杆菌W3110为研究对象,对其L-丝氨酸合成途径、降解途径、转运途径以及甘油利用途径进行改造,构建了一株以甘油为底物,发酵产L-丝氨酸的重组大肠杆菌,并对菌株进行发酵培养基优化,提高了重组大肠杆菌的发酵性能。论文的主要研究结果如下:（1）L-丝氨酸是细胞的初级代谢产物,经L-丝氨酸脱氨酶（L-ser DH）催化生成丙酮酸。通过依次敲除tdcG、sdaA、sdaB,得到重组菌GAA,L-丝氨酸积累量为0.06 g/L,但菌株的生长有所下降,OD600最大值为8.1,较野生型大肠杆菌W3110下降了12.9%,重组菌在甘油利用方面没有显著变化,发酵18 h,甘油消耗完全。（2）3-磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH）是L-丝氨酸生物合成途径的关键酶也是限速酶,受到L-丝氨酸的反馈抑制作用。定点突变PGD...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌中L-丝氨酸代谢途径
江南大学硕士学位论文脱氢酶点突变对重组大肠杆菌发酵性能的影响。（3）提高菌株甘油利用速率，依次提高培养基中甘油的浓度，连续传代培养，考察适应性进化对菌株利用甘油的影响。（4）提高重组菌丝氨酸的耐受浓度，通过过表达半胱氨酸转运蛋白编码基因 eamA或者敲除相关基因 ROORM（ompX, opgE, rhtA, rybA and mntS），考察在不同浓度 L-丝氨酸中出发菌和重组菌的生长情况。L-丝氨酸脱氨酶失活后，大肠杆菌胞内 L-丝氨酸的降解将受阻，过量积累的 L-丝氨酸对菌株的生长有一定的抑制作用[21]。因此，通过过表达具有 L-丝氨酸转运功能的半胱氨酸转运蛋白编码基因 eamA 或者敲除 ROORM 基因（这些基因编码的蛋白与细胞膜的渗透性或者是支链氨基酸转运相关），考察其对重组菌株耐受 L-丝氨酸的影响。（5）重组大肠杆菌发酵培养基优化，确定菌株发酵培养基成分的最优组合，提高重组菌株的 L-丝氨酸产量，在发酵罐上，研究重组菌的发酵工艺，提高菌株的发酵性能。
提取重组质粒。.15 大肠杆菌基因敲除的方法采用 λRed 敲除系统[43]实现目的基因的敲除以及 3-磷酸甘油酸脱氢酶（编码A）三个位点突变。以同源臂较短的基因敲除为例，具体的操作步骤如图 2-1 所 1，2 表示扩增待敲除基因两侧的同源臂的引物，3，4 表示用于敲除验证的引（1）首先制备用于基因敲除的打靶片段，靶片段主要包括待敲除基因两侧同源T 位点、抗生素筛选标记三个部分；（2）将质粒 pKD46 转入宿主中，并制备用于电转化的感受态细胞；（3）将靶片段转化到含有质粒 pKD46 感受态细胞中并加入 L-阿拉伯糖的充分D46 表达重组酶（Exo、Beta、Gam），促进靶片段中抗性筛选标记整合到染色体实现目的基因敲除；（4）将替换成功的重组菌株在平板上高温连续传代，消除菌株内部温度敏感pKD46，以不含有 pKD46 的菌株再次制备成化转感受态细胞，转入能表达 flp 重度敏感型质粒 pCP20，消除重组菌中抗生素筛选标记。再次经平板高温传代，内部质粒 pCP20，便于后续敲除其它基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展[J]. 董迅衍,王小元. 食品与生物技术学报. 2016(12)
[2]大肠杆菌丝氨酸转运系统单基因敲除对丝氨酸生产的影响[J]. 崔云风,石斌超,李晶,赵志军,史吉平,张霞. 食品工业科技. 2016(14)
[3]利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸[J]. 周丽,邓璨,崔文璟,刘中美,周哲敏. 现代食品科技. 2016(06)
[4]大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 杨冬美,李华,李由然,张梁,丁重阳,李赢,顾正华,石贵阳. 微生物学通报. 2017(01)
[5]发酵粗甘油产乳酸的戊糖乳杆菌代谢进化[J]. 王世珍,严正平,邱隆辉,方柏山. 化工学报. 2015(08)
[6]L-丝氨酸的微生物法制备研究进展[J]. 朱林江,李崎. 食品与发酵工业. 2015(01)
[7]直接发酵法生产L-丝氨酸高产菌株的选育[J]. 徐国强,窦文芳,许泓瑜,张晓梅. 食品与生物技术学报. 2014(11)
[8]Metabolic engineering and flux analysis of Corynebacterium glutamicum for L-serine production[J]. LAI ShuJuan1,2, ZHANG Yun1, LIU ShuWen1,2, LIANG Yong1, SHANG XiuLing1,2, CHAI Xin1,2 & WEN TingYi1* 1Department of Industrial Microbiology and Biotechnology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China. Science China（Life Sciences）. 2012(04)
[9]维生素对谷氨酸棒杆菌SYPS-062直接发酵合成L-丝氨酸的影响[J]. 张晓娟,窦文芳,许泓瑜,许正宏. 中国生物工程杂志. 2007(05)
[10]大肠杆菌PGDH末端缺失突变体的构建及抗反馈抑制效应分析[J]. 张绪梅,郭长江,刘云,杨继军,韦京豫,徐琪寿. 中国生物化学与分子生物学报. 2006(10)
博士论文
[1]途径工程改造大肠杆菌转化甘油合成乳酸[D]. 田康明.江南大学 2013
硕士论文
[1]谷氨酸棒杆菌L-丝氨酸竞争途径的代谢改造[D]. 朱勤健.江南大学 2015
[2]基于代谢工程改造大肠杆菌生产L-丝氨酸[D]. 贾慧慧.天津大学 2014
[3]产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌SYPS-062的代谢工程[D]. 罗玉常.江南大学 2012
[4]L-丝氨酸高产菌株的选育及基因工程菌的构建[D]. 谢玉清.新疆农业大学 2007
本文编号：3608695
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：49 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌中L-丝氨酸代谢途径
江南大学硕士学位论文脱氢酶点突变对重组大肠杆菌发酵性能的影响。（3）提高菌株甘油利用速率，依次提高培养基中甘油的浓度，连续传代培养，考察适应性进化对菌株利用甘油的影响。（4）提高重组菌丝氨酸的耐受浓度，通过过表达半胱氨酸转运蛋白编码基因 eamA或者敲除相关基因 ROORM（ompX, opgE, rhtA, rybA and mntS），考察在不同浓度 L-丝氨酸中出发菌和重组菌的生长情况。L-丝氨酸脱氨酶失活后，大肠杆菌胞内 L-丝氨酸的降解将受阻，过量积累的 L-丝氨酸对菌株的生长有一定的抑制作用[21]。因此，通过过表达具有 L-丝氨酸转运功能的半胱氨酸转运蛋白编码基因 eamA 或者敲除 ROORM 基因（这些基因编码的蛋白与细胞膜的渗透性或者是支链氨基酸转运相关），考察其对重组菌株耐受 L-丝氨酸的影响。（5）重组大肠杆菌发酵培养基优化，确定菌株发酵培养基成分的最优组合，提高重组菌株的 L-丝氨酸产量，在发酵罐上，研究重组菌的发酵工艺，提高菌株的发酵性能。
提取重组质粒。.15 大肠杆菌基因敲除的方法采用 λRed 敲除系统[43]实现目的基因的敲除以及 3-磷酸甘油酸脱氢酶（编码A）三个位点突变。以同源臂较短的基因敲除为例，具体的操作步骤如图 2-1 所 1，2 表示扩增待敲除基因两侧的同源臂的引物，3，4 表示用于敲除验证的引（1）首先制备用于基因敲除的打靶片段，靶片段主要包括待敲除基因两侧同源T 位点、抗生素筛选标记三个部分；（2）将质粒 pKD46 转入宿主中，并制备用于电转化的感受态细胞；（3）将靶片段转化到含有质粒 pKD46 感受态细胞中并加入 L-阿拉伯糖的充分D46 表达重组酶（Exo、Beta、Gam），促进靶片段中抗性筛选标记整合到染色体实现目的基因敲除；（4）将替换成功的重组菌株在平板上高温连续传代，消除菌株内部温度敏感pKD46，以不含有 pKD46 的菌株再次制备成化转感受态细胞，转入能表达 flp 重度敏感型质粒 pCP20，消除重组菌中抗生素筛选标记。再次经平板高温传代，内部质粒 pCP20，便于后续敲除其它基因。
【参考文献】：
期刊论文
[1]微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展[J]. 董迅衍,王小元. 食品与生物技术学报. 2016(12)
[2]大肠杆菌丝氨酸转运系统单基因敲除对丝氨酸生产的影响[J]. 崔云风,石斌超,李晶,赵志军,史吉平,张霞. 食品工业科技. 2016(14)
[3]利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸[J]. 周丽,邓璨,崔文璟,刘中美,周哲敏. 现代食品科技. 2016(06)
[4]大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响[J]. 杨冬美,李华,李由然,张梁,丁重阳,李赢,顾正华,石贵阳. 微生物学通报. 2017(01)
[5]发酵粗甘油产乳酸的戊糖乳杆菌代谢进化[J]. 王世珍,严正平,邱隆辉,方柏山. 化工学报. 2015(08)
[6]L-丝氨酸的微生物法制备研究进展[J]. 朱林江,李崎. 食品与发酵工业. 2015(01)
[7]直接发酵法生产L-丝氨酸高产菌株的选育[J]. 徐国强,窦文芳,许泓瑜,张晓梅. 食品与生物技术学报. 2014(11)
[8]Metabolic engineering and flux analysis of Corynebacterium glutamicum for L-serine production[J]. LAI ShuJuan1,2, ZHANG Yun1, LIU ShuWen1,2, LIANG Yong1, SHANG XiuLing1,2, CHAI Xin1,2 & WEN TingYi1* 1Department of Industrial Microbiology and Biotechnology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 2Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China. Science China（Life Sciences）. 2012(04)
[9]维生素对谷氨酸棒杆菌SYPS-062直接发酵合成L-丝氨酸的影响[J]. 张晓娟,窦文芳,许泓瑜,许正宏. 中国生物工程杂志. 2007(05)
[10]大肠杆菌PGDH末端缺失突变体的构建及抗反馈抑制效应分析[J]. 张绪梅,郭长江,刘云,杨继军,韦京豫,徐琪寿. 中国生物化学与分子生物学报. 2006(10)
博士论文
[1]途径工程改造大肠杆菌转化甘油合成乳酸[D]. 田康明.江南大学 2013
硕士论文
[1]谷氨酸棒杆菌L-丝氨酸竞争途径的代谢改造[D]. 朱勤健.江南大学 2015
[2]基于代谢工程改造大肠杆菌生产L-丝氨酸[D]. 贾慧慧.天津大学 2014
[3]产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌SYPS-062的代谢工程[D]. 罗玉常.江南大学 2012
[4]L-丝氨酸高产菌株的选育及基因工程菌的构建[D]. 谢玉清.新疆农业大学 2007
本文编号：3608695
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