高山被孢霉中CRISPR系统的构建及NADPH供应途径挖掘
发布时间：2022-01-28 01:43
高山被孢霉（Mortierella alpina）是一株高产花生四烯酸的丝状真菌,已被广泛用于工业生产花生四烯酸。目前高山被孢霉的基因组、转录组、脂质组信息已明确,基于上述信息,为进一步解析其产脂积累过程并构建高产脂菌株,单基因与双基因改造手段已不能满足研究需求,而多基因操作系统在高山被孢霉中的构建和应用未有报道。规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系统是一种功能强大且应用广泛的靶向基因敲除工具。通过诱导型启动子作用下的CRISPR系统对靶向基因如筛选标记进行反复诱导敲除,可以实现凭借单一筛选标记完成对宿主菌的多基因改造。还原力NADPH是产油微生物产脂过程所必需的成分,对脂质积累影响显著。本论文在高山被孢霉中构建了基于CRISPR系统的多基因表达策略,挖掘并筛选NADPH供应途径中的关键酶,并通过该系统实现了NADPH供应关键基因的导入以及筛选标记的二次回收,证明了该系统在高山被孢霉中的成功应用。本论文主要研究内容和实验结果如下:1.高山被孢霉转化效率的提升。为便...
【文章来源】：江南大学江苏省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
CRISPR/cas系统法作用机制示意图
第二章不同根癌农杆菌种类和高山被孢霉细胞形态对转化效率的影响25RT-VirE1-F:ATGGCCATCATCAAGCRT-VirE1-R:GAGCGGGCACCGATGGACAAART-16SrDNA-F:GTGTAGCGGTGAAATGCRT-16SrDNA-R:GTTTACGGCGTGGACTART-qPCR反应体系为：cDNA1μLSYBRGreenSupermix10μL上游引物0.5μL下游引物0.5μLddH2O8μLRT-qPCR条件：95°C10min，95°C15s，60°C1min，30个循环。2.4结果与讨论2.4.1不同根癌农杆菌中验证二元质粒的转化为探索不同根癌农杆菌种类对高山被孢霉转化效率的影响，将包含根癌农杆菌筛选标记卡那霉素片段和高山被孢霉筛选标记尿嘧啶ura5的二元验证质粒pBIG2-ura5-IT转入四种根癌农杆菌AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404感受态中。挑选在含有抗生素Kana和Rif的固体YEP平板上正常生长的菌落进行PCR验证。所用验证二元质粒为实验室前期构建，其整合进入高山被孢霉基因组的T-DNA区包含ura5片段和IT片段，可利用通用引物对HisproF1/TrpCR1进行验证。阳性转化子的PCR凝胶电泳结果应显示两条目标条带，分别为ura5条带（861bp）和IT条带（389bp）。四种根癌农杆菌转化的PCR凝胶电泳结果（图2-2）与理论一致，表明该验证二元质粒已被成功转入四种根癌农杆菌。图2-2PCR验证二元载体pBIG2-ura5-IT转化四种根癌农杆菌Fig.2-2PCRverificationofthetransformationofpBIG2-ura5-ITintofourA.tumefaciensstrains注：M:DNA标尺，A:AGL-1，C:C58C1，E:EHA105，L:LBA4404，N:阴性对照，P:阳性对照。
第二章不同根癌农杆菌种类和高山被孢霉细胞形态对转化效率的影响27表2-3根癌农杆菌中不同致毒因子的同源性分析Table2-3HomologyanalysisofdifferentvirgenesinAgrobacteriumtumefacience编号virA基因IDvirD1基因IDvirD2基因IDvirD4基因IDvirE1基因ID11224316638214812243336382151122433726381972122433263821491224335638215331224134395181713951922439518175395182064/39517457395166461224152395174775/395192233951817239517476395192766/39516688395175293951917339516558同源性91.15%89.99%85.29%90.07%86.25%注：ID号为NCBI数据库中编号，编号1～6无实际意义，只代表基因的个数。为验证设计引物的专一性，以四种根癌农杆菌菌液为底物，进行PCR验证。PCR凝胶电泳结果（图2-3）显示，针对5种不同致毒因子设计的5对引物在四种根癌农杆菌中均得到了大小相同的单一条带，表明本论文设计的引物专一性强，可用于致毒因子转录水平的测定。图2-3根癌农杆菌中致毒因子的引物验证图Fig.2-3TheelectrophoresisresultoftheprimersdesignedforvirgenesoftheAgrobacterium.注：M:DNA标尺，A:AGL-1，C:C58C1，E:EHA105，L:LBA4404，N:阴性对照，目标条带大小为230bp（virA），174bp（virD1），251bp（virD2），326bp（virD4）和165bp（virE1）。在挑选的5种致毒因子中，除VirA属于组成型蛋白外，其他4种致毒因子都属于诱导型蛋白。在进行高山被孢霉转化实验时，根癌农杆菌在加入诱导剂乙酰丁香酮（AS）12h后，才与高山被孢霉进行共培养操作。因此，除virA外，在加入诱导剂AS的12h内，每隔4h测定其余四种致毒因子virD1、virD2、virD4和virE1的转录水平变化。致
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用[J]. 还晓静,李坤,史锋,王小元. 生物工程学报. 2012(09)
[2]以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化[J]. 张学炜,王笑梅,李明春,魏东盛,陈雪,邢来君. 生物工程学报. 2007(03)
博士论文
[1]卷枝毛霉脂肪酶及其调控脂质代谢的机制[D]. 昝新艺.江南大学 2019
[2]Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用[D]. 史海粟.江南大学 2016
[3]高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力来源研究[D]. 郝光飞.江南大学 2014
[4]产油真菌高山被孢霉的脂质合成机理研究[D]. 王鸿超.江南大学 2013
[5]亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成[D]. 张白曦.江南大学 2013
硕士论文
[1]高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的筛选鉴定及功能探究[D]. 曹珺.江南大学 2019
[2]异柠檬酸脱氢酶对高山被孢霉脂质合成作用的研究[D]. 孙晓琪.江南大学 2019
[3]亚甲基四氢叶酸脱氢酶对高山被孢霉脂肪酸合成的调控作用[D]. 汪企再.江南大学 2018
[4]双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究[D]. 张小可.江南大学 2018
[5]PAH和SSADH基因调控对高山被孢霉脂质合成的影响[D]. 王春梅.江南大学 2018
[6]产油丝状真菌的筛选及诱变育种[D]. 姚青蔚.江南大学 2017
[7]四氢生物蝶呤对高山被孢霉脂质合成的调控机制[D]. 张陈.江南大学 2017
[8]三孢布拉霉基因转化方法研究[D]. 黄琼瑶.华中科技大学 2011
本文编号：3613456
【文章来源】：江南大学江苏省211工程院校教育部直属院校
【文章页数】：95 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
CRISPR/cas系统法作用机制示意图
第二章不同根癌农杆菌种类和高山被孢霉细胞形态对转化效率的影响25RT-VirE1-F:ATGGCCATCATCAAGCRT-VirE1-R:GAGCGGGCACCGATGGACAAART-16SrDNA-F:GTGTAGCGGTGAAATGCRT-16SrDNA-R:GTTTACGGCGTGGACTART-qPCR反应体系为：cDNA1μLSYBRGreenSupermix10μL上游引物0.5μL下游引物0.5μLddH2O8μLRT-qPCR条件：95°C10min，95°C15s，60°C1min，30个循环。2.4结果与讨论2.4.1不同根癌农杆菌中验证二元质粒的转化为探索不同根癌农杆菌种类对高山被孢霉转化效率的影响，将包含根癌农杆菌筛选标记卡那霉素片段和高山被孢霉筛选标记尿嘧啶ura5的二元验证质粒pBIG2-ura5-IT转入四种根癌农杆菌AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404感受态中。挑选在含有抗生素Kana和Rif的固体YEP平板上正常生长的菌落进行PCR验证。所用验证二元质粒为实验室前期构建，其整合进入高山被孢霉基因组的T-DNA区包含ura5片段和IT片段，可利用通用引物对HisproF1/TrpCR1进行验证。阳性转化子的PCR凝胶电泳结果应显示两条目标条带，分别为ura5条带（861bp）和IT条带（389bp）。四种根癌农杆菌转化的PCR凝胶电泳结果（图2-2）与理论一致，表明该验证二元质粒已被成功转入四种根癌农杆菌。图2-2PCR验证二元载体pBIG2-ura5-IT转化四种根癌农杆菌Fig.2-2PCRverificationofthetransformationofpBIG2-ura5-ITintofourA.tumefaciensstrains注：M:DNA标尺，A:AGL-1，C:C58C1，E:EHA105，L:LBA4404，N:阴性对照，P:阳性对照。
第二章不同根癌农杆菌种类和高山被孢霉细胞形态对转化效率的影响27表2-3根癌农杆菌中不同致毒因子的同源性分析Table2-3HomologyanalysisofdifferentvirgenesinAgrobacteriumtumefacience编号virA基因IDvirD1基因IDvirD2基因IDvirD4基因IDvirE1基因ID11224316638214812243336382151122433726381972122433263821491224335638215331224134395181713951922439518175395182064/39517457395166461224152395174775/395192233951817239517476395192766/39516688395175293951917339516558同源性91.15%89.99%85.29%90.07%86.25%注：ID号为NCBI数据库中编号，编号1～6无实际意义，只代表基因的个数。为验证设计引物的专一性，以四种根癌农杆菌菌液为底物，进行PCR验证。PCR凝胶电泳结果（图2-3）显示，针对5种不同致毒因子设计的5对引物在四种根癌农杆菌中均得到了大小相同的单一条带，表明本论文设计的引物专一性强，可用于致毒因子转录水平的测定。图2-3根癌农杆菌中致毒因子的引物验证图Fig.2-3TheelectrophoresisresultoftheprimersdesignedforvirgenesoftheAgrobacterium.注：M:DNA标尺，A:AGL-1，C:C58C1，E:EHA105，L:LBA4404，N:阴性对照，目标条带大小为230bp（virA），174bp（virD1），251bp（virD2），326bp（virD4）和165bp（virE1）。在挑选的5种致毒因子中，除VirA属于组成型蛋白外，其他4种致毒因子都属于诱导型蛋白。在进行高山被孢霉转化实验时，根癌农杆菌在加入诱导剂乙酰丁香酮（AS）12h后，才与高山被孢霉进行共培养操作。因此，除virA外，在加入诱导剂AS的12h内，每隔4h测定其余四种致毒因子virD1、virD2、virD4和virE1的转录水平变化。致
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷氨酸棒杆菌NAD激酶的过表达对L-异亮氨酸合成的促进作用[J]. 还晓静,李坤,史锋,王小元. 生物工程学报. 2012(09)
[2]以潮霉素B抗性为选择标记的深黄被孢霉原生质体转化[J]. 张学炜,王笑梅,李明春,魏东盛,陈雪,邢来君. 生物工程学报. 2007(03)
博士论文
[1]卷枝毛霉脂肪酶及其调控脂质代谢的机制[D]. 昝新艺.江南大学 2019
[2]Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用[D]. 史海粟.江南大学 2016
[3]高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力来源研究[D]. 郝光飞.江南大学 2014
[4]产油真菌高山被孢霉的脂质合成机理研究[D]. 王鸿超.江南大学 2013
[5]亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成[D]. 张白曦.江南大学 2013
硕士论文
[1]高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的筛选鉴定及功能探究[D]. 曹珺.江南大学 2019
[2]异柠檬酸脱氢酶对高山被孢霉脂质合成作用的研究[D]. 孙晓琪.江南大学 2019
[3]亚甲基四氢叶酸脱氢酶对高山被孢霉脂肪酸合成的调控作用[D]. 汪企再.江南大学 2018
[4]双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究[D]. 张小可.江南大学 2018
[5]PAH和SSADH基因调控对高山被孢霉脂质合成的影响[D]. 王春梅.江南大学 2018
[6]产油丝状真菌的筛选及诱变育种[D]. 姚青蔚.江南大学 2017
[7]四氢生物蝶呤对高山被孢霉脂质合成的调控机制[D]. 张陈.江南大学 2017
[8]三孢布拉霉基因转化方法研究[D]. 黄琼瑶.华中科技大学 2011
本文编号：3613456
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