产丁二酮芽孢杆菌的改造及发酵优化
发布时间：2022-08-09 18:39
丁二酮是一种常见的C4平台化合物,在食品、化工等领域有着广泛的应用。传统上生产丁二酮的方法包括天然产物提取法及化学合成法等,但二者均存在成本较高、污染严重等缺点。近年来微生物发酵法生产丁二酮受到越来越多的关注。本课题以产丁二酮的芽孢杆菌Bacillus sp.DL01-ΔalsD作为出发菌株,对该菌株进行代谢途径改造以及发酵条件优化,最大限度地提高该菌株中丁二酮的产量,为工业上利用微生物发酵法生产丁二酮提供理论依据。以B.sp.DL01-ΔalsD为出发菌株,构建温敏型质粒pKS1-pta,利用无痕敲除技术将菌株乙酸代谢途径上的关键酶磷酸转乙酰基酶（PTA）的编码基因pta敲除,获得菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta。摇瓶发酵实验结果表明,敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的乙酸产量明显下降,丁二酮的产量显著提高,达到3.67 g/L,是出发菌株B.sp.DL01-ΔalsD（2.82 g/L）的1.3倍。克隆来自于B.subtilis 168的乙酰乳酸合成酶基因,构建过表达质粒,转化B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta,获得重组B.sp.DL01-Δals...
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 丁二酮概述
1.1.1 生物基四碳平台化合物及其应用
1.1.2 丁二酮的性质及用途
1.1.3 丁二酮的制备方法
1.1.4 丁二酮的检测方法
1.2 芽孢杆菌的概况
1.2.1 芽孢杆菌的特性及用途
1.2.2 芽孢杆菌的中心碳代谢途径
1.3 微生物法合成丁二酮的代谢途径
1.3.1 丁二酮的生产菌株
1.3.2 丁二酮的代谢途径
1.4 提高丁二酮生物合成的策略
1.4.1 优化生产菌株
1.4.2 优化发酵培养基
1.4.3 优化发酵条件
1.5 数学建模在微生物发酵中的应用
1.5.1 BP神经网络与遗传算法
1.5.2 数学建模的应用
1.6 本课题研究的意义和内容
1.6.1 本课题研究的目的及意义
1.6.2 本课题研究的内容
2 阻断芽孢杆菌B.sp.DL01-△alsD生成乙酸
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验仪器
2.2.2 主要实验材料
2.3 实验方法
2.3.1 主要溶液配制
2.3.2 菌株B.sp.DL01-△alsD的耐药性实验
2.3.3 磷酸转乙酰基酶编码基因pta的扩增
2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.5 重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞
2.3.6 敲除质粒pKS1-pta的构建
2.3.7 B.sp.DL01-△alsD感受态细胞的制备
2.3.8 敲除质粒pKS1-pta转化到B.sp.DL01-△alsD感受态细胞
2.3.9 基因pta的温度诱导无标记敲除
2.3.10 菌体生长动力学曲线的绘制
2.3.11 葡萄糖消耗动力学曲线的绘制
2.3.12 发酵液中产物生成动力学曲线的绘制
2.3.13 统计学分析
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 B.sp.DL01-ΔalsD的耐药性分析
2.4.2 pta基因上下游片段的扩增及鉴定
2.4.3 敲除质粒pKS1-pta的构建
2.4.4 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的筛选及验证
2.4.5 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的生长动力学曲线
2.4.6 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的葡萄糖消耗动力学曲线
2.4.7 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的发酵产物动力学曲线
2.5 本章小结
3 强化芽孢杆菌B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta丁二酮的合成
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验仪器
3.2.2 主要实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 主要溶液的配制
3.3.2 乙酰乳酸合成酶编码基因alsS的扩增
3.3.3 重组质粒pHY300PLK-Pals-alsS168的构建
3.3.4 重组菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168 的构建
3.3.5 乙酰乳酸合成酶的活性测定
3.3.6 菌体生长动力学曲线的绘制
3.3.7 葡萄糖消耗动力学曲线的绘制
3.3.8 发酵液中产物生成动力学曲线的绘制
3.3.9 统计学分析
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 乙酰乳酸合成酶的筛选结果
3.4.2 乙酰乳酸合成酶编码基因alsS168的扩增及鉴定结果
3.4.3 重组菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168 的构建
3.4.4 乙酰乳酸合成酶的表达与活性分析
3.4.5 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的生长动力学曲线
3.4.6 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的葡萄糖消耗动力学曲线
3.4.7 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的发酵产物动力学曲线
3.5 本章小结
4 工程菌B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的发酵条件优化
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验仪器
4.2.2 主要实验材料
4.3 实验方法
4.3.1 主要溶液的配制
4.3.2 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168培养方法
4.3.3 菌体生长动力学曲线的绘制
4.3.4 葡萄糖消耗动力学曲线的绘制
4.3.5 发酵液中产物生成动力学曲线的绘制
4.3.6 正交实验
4.3.7 BP神经网络建模
4.3.8 遗传算法对发酵条件的优化
4.3.9 统计学分析
4.4 实验结果与讨论
4.4.1 发酵条件对丁二酮发酵的影响
4.4.2 发酵条件的初步优化
4.4.3 BP神经网络的构建
4.4.4 最优发酵条件的确定
4.4.5 发酵罐水平恒底物补料对丁二酮发酵的影响
4.4.6 丁二酮回收装置的改进
4.5 本章小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于人工神经网络算法的渤海海风预报方法研究[J]. 杨晓君,张楠,陈宏,从靖,徐威. 干旱气象. 2019(01)
[2]啤酒中常见异味成分控制的研究进展[J]. 崔云前,苏文超,吴梓萌,张海梦. 中国酿造. 2019(01)
[3]市场展望:全球化工稳中趋升[J]. 上海化工. 2018(02)
[4]2020年全球香精香料市场规模将达到300亿美元[J]. 张红梅. 中国洗涤用品工业. 2017(12)
[5]2,3-丁二酮缩氨基硫脲Schiff碱稀土铽配合物的合成及抗肿瘤活性[J]. 邱梦婕,钟霞,郭娅婷,张丹蕾,邱妹,赵伟楠. 科技创新导报. 2017(29)
[6]乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响[J]. 陶然,毛雨丰,付晶,黄灿,王智文,陈涛. 微生物学通报. 2017(11)
[7]中国领跑2017年全球化学品市场[J]. 边际. 上海化工. 2017(03)
[8]一株高产丁二酮菌株的筛选与鉴定[J]. 粟桂蓉,周璐璐,易浪波,彭清静,彭清忠. 吉首大学学报(自然科学版). 2016(02)
[9]试验设计在苏云金芽孢杆菌培养基优化中的应用[J]. 郭慧慧. 闽东农业科技. 2016 (01)
[10]生物法制备平台化合物乙偶姻的最新研究进展[J]. 刘晓霏,付晶,霍广鑫,章博,王智文,陈涛. 中国生物工程杂志. 2015(10)
博士论文
[1]芽孢杆菌产丁二酮的代谢调控及发酵优化[D]. 郝文博.大连理工大学 2016
硕士论文
[1]基于双乙酰的切达奶酪奶香味的改善研究[D]. 殷俊玲.江南大学 2016
[2]发酵法生产2,3-丁二酮及中试条件优化[D]. 魏彦锋.齐鲁工业大学 2015
[3]应用代谢通量分析优化小球藻产油代谢体系[D]. 朱怡航.浙江农林大学 2014
[4]应用BP神经网络和遗传算法优化苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29、BRC-LLB19及BRC-ZQL3菌株的发酵培养基[D]. 郭慧慧.福建农林大学 2013
[5]基于Matlab的鼠李糖脂发酵生产参数优化方法设计与实现[D]. 赵力.吉林大学 2012
[6]一种2，3-丁二酮合成方法的研究[D]. 周全.湖南师范大学 2011
[7]小型化宽带加载天线的研究[D]. 刘扬.杭州电子科技大学 2011
[8]噻唑盐催化偶姻缩合反应研究[D]. 陈益民.湖南师范大学 2010
[9]基于小波变换和遗传神经网络的癫痫智能诊断[D]. 陈明静.郑州大学 2009
[10]丁二酮产生菌的选育及代谢控制发酵研究[D]. 赵玲.大连理工大学 2008
本文编号：3673076
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 丁二酮概述
1.1.1 生物基四碳平台化合物及其应用
1.1.2 丁二酮的性质及用途
1.1.3 丁二酮的制备方法
1.1.4 丁二酮的检测方法
1.2 芽孢杆菌的概况
1.2.1 芽孢杆菌的特性及用途
1.2.2 芽孢杆菌的中心碳代谢途径
1.3 微生物法合成丁二酮的代谢途径
1.3.1 丁二酮的生产菌株
1.3.2 丁二酮的代谢途径
1.4 提高丁二酮生物合成的策略
1.4.1 优化生产菌株
1.4.2 优化发酵培养基
1.4.3 优化发酵条件
1.5 数学建模在微生物发酵中的应用
1.5.1 BP神经网络与遗传算法
1.5.2 数学建模的应用
1.6 本课题研究的意义和内容
1.6.1 本课题研究的目的及意义
1.6.2 本课题研究的内容
2 阻断芽孢杆菌B.sp.DL01-△alsD生成乙酸
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验仪器
2.2.2 主要实验材料
2.3 实验方法
2.3.1 主要溶液配制
2.3.2 菌株B.sp.DL01-△alsD的耐药性实验
2.3.3 磷酸转乙酰基酶编码基因pta的扩增
2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.3.5 重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞
2.3.6 敲除质粒pKS1-pta的构建
2.3.7 B.sp.DL01-△alsD感受态细胞的制备
2.3.8 敲除质粒pKS1-pta转化到B.sp.DL01-△alsD感受态细胞
2.3.9 基因pta的温度诱导无标记敲除
2.3.10 菌体生长动力学曲线的绘制
2.3.11 葡萄糖消耗动力学曲线的绘制
2.3.12 发酵液中产物生成动力学曲线的绘制
2.3.13 统计学分析
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 B.sp.DL01-ΔalsD的耐药性分析
2.4.2 pta基因上下游片段的扩增及鉴定
2.4.3 敲除质粒pKS1-pta的构建
2.4.4 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的筛选及验证
2.4.5 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的生长动力学曲线
2.4.6 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的葡萄糖消耗动力学曲线
2.4.7 敲除菌株B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta的发酵产物动力学曲线
2.5 本章小结
3 强化芽孢杆菌B.sp.DL01-ΔalsD-Δpta丁二酮的合成
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验仪器
3.2.2 主要实验材料
3.3 实验方法
3.3.1 主要溶液的配制
3.3.2 乙酰乳酸合成酶编码基因alsS的扩增
3.3.3 重组质粒pHY300PLK-Pals-alsS168的构建
3.3.4 重组菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168 的构建
3.3.5 乙酰乳酸合成酶的活性测定
3.3.6 菌体生长动力学曲线的绘制
3.3.7 葡萄糖消耗动力学曲线的绘制
3.3.8 发酵液中产物生成动力学曲线的绘制
3.3.9 统计学分析
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 乙酰乳酸合成酶的筛选结果
3.4.2 乙酰乳酸合成酶编码基因alsS168的扩增及鉴定结果
3.4.3 重组菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168 的构建
3.4.4 乙酰乳酸合成酶的表达与活性分析
3.4.5 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的生长动力学曲线
3.4.6 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的葡萄糖消耗动力学曲线
3.4.7 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的发酵产物动力学曲线
3.5 本章小结
4 工程菌B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168的发酵条件优化
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验仪器
4.2.2 主要实验材料
4.3 实验方法
4.3.1 主要溶液的配制
4.3.2 菌株B.sp.DL01-ΔalsD-△pta-alsS168培养方法
4.3.3 菌体生长动力学曲线的绘制
4.3.4 葡萄糖消耗动力学曲线的绘制
4.3.5 发酵液中产物生成动力学曲线的绘制
4.3.6 正交实验
4.3.7 BP神经网络建模
4.3.8 遗传算法对发酵条件的优化
4.3.9 统计学分析
4.4 实验结果与讨论
4.4.1 发酵条件对丁二酮发酵的影响
4.4.2 发酵条件的初步优化
4.4.3 BP神经网络的构建
4.4.4 最优发酵条件的确定
4.4.5 发酵罐水平恒底物补料对丁二酮发酵的影响
4.4.6 丁二酮回收装置的改进
4.5 本章小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于人工神经网络算法的渤海海风预报方法研究[J]. 杨晓君,张楠,陈宏,从靖,徐威. 干旱气象. 2019(01)
[2]啤酒中常见异味成分控制的研究进展[J]. 崔云前,苏文超,吴梓萌,张海梦. 中国酿造. 2019(01)
[3]市场展望:全球化工稳中趋升[J]. 上海化工. 2018(02)
[4]2020年全球香精香料市场规模将达到300亿美元[J]. 张红梅. 中国洗涤用品工业. 2017(12)
[5]2,3-丁二酮缩氨基硫脲Schiff碱稀土铽配合物的合成及抗肿瘤活性[J]. 邱梦婕,钟霞,郭娅婷,张丹蕾,邱妹,赵伟楠. 科技创新导报. 2017(29)
[6]乙酸合成途径阻断及NADH氧化酶表达对于谷氨酸棒杆菌生产乙偶姻的影响[J]. 陶然,毛雨丰,付晶,黄灿,王智文,陈涛. 微生物学通报. 2017(11)
[7]中国领跑2017年全球化学品市场[J]. 边际. 上海化工. 2017(03)
[8]一株高产丁二酮菌株的筛选与鉴定[J]. 粟桂蓉,周璐璐,易浪波,彭清静,彭清忠. 吉首大学学报(自然科学版). 2016(02)
[9]试验设计在苏云金芽孢杆菌培养基优化中的应用[J]. 郭慧慧. 闽东农业科技. 2016 (01)
[10]生物法制备平台化合物乙偶姻的最新研究进展[J]. 刘晓霏,付晶,霍广鑫,章博,王智文,陈涛. 中国生物工程杂志. 2015(10)
博士论文
[1]芽孢杆菌产丁二酮的代谢调控及发酵优化[D]. 郝文博.大连理工大学 2016
硕士论文
[1]基于双乙酰的切达奶酪奶香味的改善研究[D]. 殷俊玲.江南大学 2016
[2]发酵法生产2,3-丁二酮及中试条件优化[D]. 魏彦锋.齐鲁工业大学 2015
[3]应用代谢通量分析优化小球藻产油代谢体系[D]. 朱怡航.浙江农林大学 2014
[4]应用BP神经网络和遗传算法优化苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29、BRC-LLB19及BRC-ZQL3菌株的发酵培养基[D]. 郭慧慧.福建农林大学 2013
[5]基于Matlab的鼠李糖脂发酵生产参数优化方法设计与实现[D]. 赵力.吉林大学 2012
[6]一种2，3-丁二酮合成方法的研究[D]. 周全.湖南师范大学 2011
[7]小型化宽带加载天线的研究[D]. 刘扬.杭州电子科技大学 2011
[8]噻唑盐催化偶姻缩合反应研究[D]. 陈益民.湖南师范大学 2010
[9]基于小波变换和遗传神经网络的癫痫智能诊断[D]. 陈明静.郑州大学 2009
[10]丁二酮产生菌的选育及代谢控制发酵研究[D]. 赵玲.大连理工大学 2008
本文编号：3673076
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3673076.html
