核酸酶P1的分离纯化及作为工具酶的研究

发布时间：2022-12-18 06:01

　　核酸酶P1是由桔青霉发酵生产的一种含锌金属酶,主要用于工业生产核苷酸,但国内的核酸酶P1产率和纯度均不高,大量的依赖进口。本论文主要对由桔青霉发酵生产的核酸酶P1进行分离纯化,在此基础上研究了纯化后核酸酶P1的酶学特性,并进一步对核酸酶P1作为工具酶应用于基因工程领域进行了探究。经研究得核酸酶P1的主要分离技术为:粗酶液先进行热处理,硫酸铵分级沉淀,透析,再进行葡聚糖凝胶G75过滤层析、DEAE-纤维素52离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析得到核酸酶P1纯酶液。经过整个纯化过程,总酶活回收率约20-30%,核酸酶P1被纯化了3.05倍,通过SDS-PAGE检测为分子量约36 kDa的单一条带。对核酸酶P1的酶学特性研究表明,核酸酶P1的最适反应温度为70℃,在70℃处理1 h,酶活回收率为87%。最适的反应缓冲体系是pH 5.4的醋酸缓冲液。低浓度Zn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺能轻微促进核酸酶P1的酶活,高浓度的金属离子对核酸酶P1具有抑制作用,Cu²⁺和Fe³⁺的抑制效果最为明显... 

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 核酸酶P1概述
        1.1.1核酸酶P1
        1.1.2 核酸酶P1的性质
            1.1.2.1 核酸酶P1的酶解特性
            1.1.2.2 核酸酶P1的结构
            1.1.2.3 金属离子对核酸酶P1酶活的影响
        1.1.3 核酸酶P1的生产
        1.1.4 核酸酶P1的用途
    1.2 蛋白质的分离纯化
        1.2.1 蛋白质的分离纯化常用方法
            1.2.1.2 硫酸铵沉淀
            1.2.1.3 凝胶过滤层析
            1.2.1.4 离子交换层析
            1.2.1.5 亲和层析
            1.2.1.6 其他层析技术
            1.2.1.7 电泳
        1.2.2 微生物酶分离纯化一般过程
    1.3 工具酶
    1.4 本文研究目的和研究内容
第2章 核酸酶P1粗酶液分析
    2.1 核酸酶P1的生产来源
    2.2 粗酶液的分析
        2.2.1 试剂与仪器
        2.2.2 粗酶液中核酸酶P1的酶活测定
            2.2.2.1 试剂配制
            2.2.2.2 粗酶液中核酸酶P1酶活测定
        2.2.3 粗酶液中核酸酶P1的蛋白质含量测定
        2.2.4 粗酶液中蛋白质大小检测
            2.2.4.1 试剂配制
            2.2.4.2 SDS-PAGE的制作
    2.3 结果与讨论
    2.4 本章小结
第3章 核酸酶P1的分离纯化
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 试剂与仪器
        3.2.2 粗酶液的热处理
        3.2.3 硫酸铵分级沉淀
        3.2.4 透析
        3.2.5 葡聚糖凝胶过滤层析
        3.2.6 DEAE-纤维素52阴离子交换层析
        3.2.7 SDS-PAGE检测核酸酶P1 的纯度
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 热处理实验结果
        3.3.2 硫酸铵分级实验结果
        3.3.3 SDS-PAGE检测初步纯化结果
        3.3.4 葡聚糖凝胶过滤结果
        3.3.5 DEAE-纤维素52离子交换层析实验结果
        3.3.6 葡聚糖凝胶过滤层析实验结果
        3.3.7 SDS-PAGE检测层析后样品纯度
    3.4 本章小结
第4章 核酸酶P1的酶学特性
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验所需试剂及仪器
        4.2.2 核酸酶P1的最适反应温度
        4.2.3 核酸酶P1反应的最适pH和pH体系
        4.2.4 金属离子对核酸酶P1酶活性的影响
        4.2.5 核酸酶P1的动力学参数
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 最适反应温度
        4.3.2 最适反应pH及缓冲体系
        4.3.3 金属离子和有机试剂对核酸酶P1酶活的影响
        4.3.4 动力学模拟实验结果
    4.4 本章小结
第5章 核酸酶P1的应用研究
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 仪器与试剂
        5.2.2 提高核酸酶P1的保存稳定研究
        5.2.3 核酸酶P1的应用研究
    5.3 结果与讨论
    5.4 本章小结
第6章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
致谢
参考文献
附录1 攻读硕士学位期间发表的论文
附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目


【参考文献】：
期刊论文
[1]黑曲霉C2J6脂肪酶的保存稳定性研究[J]. 苏雪林,董佩娜,万银松,刘娅.  中国酿造. 2018(06)
[2]桔青霉产核酸酶P1菌种高效选育方法研究[J]. 郑美娟,郭金玲,田毅红,雷生姣,吕育财,余华顺,姚鹃,王栋,龚大春.  化学与生物工程. 2018(02)
[3]添加剂提高酶稳定性研究进展[J]. 王亚军,曹块.  发酵科技通讯. 2016(03)
[4]酶分子稳定性改造研究进展[J]. 冯旭东,吕波,李春.  化工学报. 2016(01)
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[9]响应面法优化桔青霉产核酸酶P1培养基[J]. 喻晨,张亚雄,赵劼,朱昌雄,杨海珍,姚鹃.  食品科学. 2011(17)
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硕士论文
[1]桔青霉来源的核酸酶P1在黑曲霉系统中的重组表达研究[D]. 陈筱仪.华南理工大学 2019
[2]核酸酶P1在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析[D]. 王亚楠.西北农林科技大学 2012
[3]产核酸酶P1菌株的诱变选育及发酵动力学研究[D]. 廖明义.华中农业大学 2011
[4]酶法水解DNA制备5’-脱氧核甘酸的研究[D]. 吴永宏.南京工业大学 2005



本文编号：3721493