基于盖子结构氨基酸的高压模拟改善T1脂肪酶的鲁棒性研究

发布时间：2023-01-04 10:44

　　T1脂肪酶是重要的工业用酶之一,在实际工业应用中经常会受到高温、高压、极端pH等条件的胁迫,导致酶的稳定性和催化活性大打折扣,即鲁棒性较差,最终造成生产损失率高、生产成本增加等问题。因此,对T1脂肪酶进行合理改造获得鲁棒性强的突变体脂肪酶以扩大该酶的应用价值显得尤为重要。针对极端条件下T1脂肪酶鲁棒性较差的现状,本研究在高压扰动条件下对盖子结构进行分子动力学模拟,通过FoldX计算自由能以及稳定性预测软件I-mutant 2.0、STRUM和DynaMut的联合预测对突变体进行筛选。再进一步通过实验验证获得了鲁棒性增强的T1脂肪酶突变体,使T1脂肪酶能更好地适应工业生产的需求。主要研究内容如下:（1）在不同压力下（1Bar,100Bar,500Bar,1000Bar,2000Bar,4000Bar）对T1脂肪酶进行分子动力学模拟,通过计算B-Factor、RMSD、RMSF和Rg值分析脂肪酶结构的变化趋势,确定与脂肪酶功能密切相关的关键区域为盖子结构域的a6螺旋。对该区域的氨基酸进行虚拟饱和突变,通过FoldX选择自由能变化小于0的突变体,构建突变体库。再使用I-mutant 2.0、... 

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 脂肪酶概述
        1.1.1 脂肪酶简介
        1.1.2 脂肪酶的应用
        1.1.3 脂肪酶鲁棒性研究进展
        1.1.4 脂肪酶压力耐受机制
    1.2 酶的分子改造策略及研究进展
        1.2.1 定向进化
        1.2.2 理性设计
        1.2.3 半理性设计
    1.3 T1脂肪酶概述
        1.3.1 T1脂肪酶来源及理化性质
        1.3.2 T1脂肪酶结构及催化机理
        1.3.3 T1脂肪酶的应用价值
        1.3.4 T1脂肪酶的分子改造研究进展
    1.4 论文的立题依据和主要研究内容
        1.4.1 立题依据
        1.4.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 模拟与分析软件
        2.1.2 菌株与质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 主要培养基与溶液
    2.2 高鲁棒性阳性突变体的虚拟筛选
        2.2.1 基于高压模拟的T1脂肪酶鲁棒性进化原理
        2.2.2 基于高压模拟的T1脂肪酶强鲁棒性区域的筛选
        2.2.3 基于多个预测软件的突变体联合筛选
    2.3 突变体的构建与筛选
        2.3.1 重组质粒pET28a-T1载体的构建
        2.3.2 感受态细胞的制备及转化
        2.3.3 重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定
        2.3.4 单点突变体重组质粒的构建
        2.3.5 复合突变体重组质粒的构建
    2.4 野生型及突变体T1脂肪酶的分离纯化和活力检测
        2.4.1 脂肪酶的诱导表达
        2.4.2 脂肪酶的分离纯化
        2.4.3 蛋白质浓度的测定
        2.4.4 对硝基苯酚标准曲线制作
        2.4.5 脂肪酶的酶活测定
    2.5 野生型及突变体T1脂肪酶酶学性质测定
        2.5.1 动力学参数测定
        2.5.2 圆二色谱分析
        2.5.3 最适温度及稳定度稳定性测定
        2.5.4 最适pH和pH稳定性测定
        2.5.5 有机溶剂及金属离子耐受性测定
        2.5.6 底物选择性测定
第三章 结果与讨论
    3.1 高鲁棒性阳性突变体的虚拟筛选
        3.1.1 T1脂肪酶高鲁棒性区域及位点的虚拟筛选
        3.1.2 基于FoldX自由能计算的突变体筛选
        3.1.3 基于STRUM、I-mutant2.0和Dyna Mut的突变体复筛
        3.1.4 小结
    3.2 单点突变体酶学性质表征
        3.2.1 重组表达载体的验证
        3.2.2 脂肪酶的分离纯化及活力测定
        3.2.3 动力学参数及圆二色谱分析
        3.2.4 温度及pH对脂肪酶活性的影响
        3.2.5 有机溶剂及金属离子耐受性测定
        3.2.6 底物选择性测定
        3.2.7 小结
    3.3 复合突变体酶学性质表征
        3.3.1 重组表达载体的验证
        3.3.2 脂肪酶的分离纯化及活力测定
        3.3.3 动力学参数及半解折叠温度测定
        3.3.4 温度及pH对脂肪酶活性的影响
        3.3.5 有机溶剂及金属离子对脂肪酶活性的影响
        3.3.6 底物选择性测定
        3.3.7 小结
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间的科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]金属离子对重组深渊滕黄单胞菌低温α-淀粉酶LamA的活性和稳定性影响[J]. 孙清扬,张静静,李冰清,王岩,张晓华.  微生物学通报. 2019(11)
[2]表面活性剂对T1脂肪酶活力的影响[J]. 唐庆芸,王永华.  现代食品科技. 2017(03)
[3]固定化嗜热嗜碱土芽孢杆菌T1脂肪酶的制备及其催化特性研究[J]. 汪璞,王方华,唐庆芸,王永华,杨博.  现代食品科技. 2015(05)
[4]来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究[J]. 余小霞,刘晓青,田健,伍宁丰.  中国农业科技导报. 2015(01)
[5]微生物脂肪酶应用研究进展[J]. 兰立新,肖怀秋.  安徽农业科学. 2010(14)

博士论文
[1]盖子区域疏水氨基酸调节脂肪酶T1界面吸附和水解活力的机制研究[D]. 辛瑞璞.华南理工大学 2017

硕士论文
[1]基于复杂网络理论和分子动力学模拟的脂肪酶热稳定性的研究[D]. 张雷雨.江南大学 2017
[2]基于B-factor饱和突变法筛选热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体[D]. 邱黎清.福建师范大学 2015



本文编号：3727631