靶向水稻黄单胞菌FtsZ蛋白的新型杀菌剂合成与生物活性研究
发布时间：2023-02-05 14:48
目前,针对农作物细菌性病害的防治药剂,如叶枯唑,噻菌铜已使用多年,随之而来的毒性问题和频繁的抗药性问题,迫切需要一批新颖的、高效的杀菌剂进行替代。在寻找新靶标的过程中,细胞分裂蛋白FtsZ,作为真核生物微管蛋白的同源类似物,同为GTP酶家族的一员,在细菌的二分裂进程中极为重要。因此,近年在医药领域中,探索并发展了许多以FtsZ为靶标的杀菌剂,其能够通过干扰FtsZ的聚集,从而达到抑制细菌二分裂的目的。因此,以FtsZ为靶标的杀菌剂的研发也显现出了强有力的应用前景。本论文通过结构设计及修饰、计算机辅助验证,初步确定化合物设计的可行性,随后通过化合物的合成,活性测试,靶向性验证等一系列验证方法,首次合成了一类靶向水稻黄单胞菌FtsZ的抑制剂。同时,建立了基于水稻黄单胞菌FtsZ蛋白为作用靶标的药物筛选平台,通过离体的杀菌活性测试、细菌的形态学观察以及离体的酶活性筛选,综合评价化合物的靶向性,为寻找具有靶向水稻黄单胞菌FtsZ蛋白的先导结构提供技术支撑。现将本论文工作总结如下:（1）设计、合成了3个系列共75个化合物。其中Ⅰ系列22个,Ⅱ系列29个化合物,Ⅲ系列24个化合物。所有化合物的结构...
【文章页数】：262 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语列表
前言
第一章 文献综述
1.1 农药的发展简史
1.2 植物细菌性病害及研究现状
1.3 靶标研究的重要性
1.4 FtsZ抑制剂的研究现状
1.4.1 FtsZ蛋白的结构和功能
1.4.2 FtsZ的特点
1.4.3 作用于FtsZ蛋白的医药类小分子抑制剂
1.4.4 作用于微管蛋白的农药类小分子抑制剂
1.4.5 FtsZ蛋白与tubulin及其抑制剂的异同点
1.5 计算机辅助药物分子设计简要
1.5.1 同源模建(Homology modeling)
1.5.2 分子对接
1.6 本论文的立题思路与目的
1.6.1 研究目的及意义
1.6.2 研究方案
1.6.3 研究内容
第二章 同源模建与分子对接
2.1 FtsZ蛋白的同源模建
2.2 FtsZ蛋白与小分子的分子对接
2.2.1 受体预处理及原型分子生成
2.2.2 小分子配体的来源及准备
2.2.3 参数设置
2.2.4 结果与讨论
2.3 本章小结
第三章 目标化合物的合成
3.1 实验仪器与试剂
3.1.1 有机合成实验部分
3.1.2 生化实验部分
3.2 目标化合物的合成
3.2.1 Ⅰ系列N'-肉桂酰取代的肉桂酸酰肼衍生物的合成
3.2.2 Ⅱ系列(Z)-5-苯乙烯基罗丹宁-N-苯基乙酰胺类衍生物的合成
3.2.3 Ⅲ系列含(E)N’-肉桂酰基-3-(吡啶-3-基)丙烯酰肼结构的吡啶盐衍生物的合成
3.3 本章小结
第四章 靶向FtsZ蛋白的目标化合物的作用机制研究
4.1 实验材料
4.2 水稻黄单胞菌FtsZ蛋白克隆、表达和纯化
4.2.1 ftsZ基因的载体构建
4.2.2 重组质粒的转化
4.2.3 XooFtsZ蛋白的小试表达
4.2.4 表达菌的扩大培养
4.2.5 XooFtsZ蛋白的纯化
4.2.6 XooFtsZ蛋白的浓度测定
4.3 水稻黄单胞菌FtsZ的 GTPase活性实验条件筛选
4.3.1 标准曲线的绘制
4.3.2 FtsZ蛋白的酶活性实验条件筛选
4.4 水稻黄单胞菌FtsZ与小分子的相互作用实验
4.4.1 实验原理及数据分析方法
4.4.2 实验方法
4.5 水稻黄单胞菌FtsZ的自组装实验
4.6 水稻黄单胞菌FtsZ的二级结构变化
4.7 水稻黄单胞菌的形态学观察
4.8 本章小结
第五章 目标化合物的生物活性测试
5.1 抗植物病原细菌活性方法
5.2 体外抗肿瘤活性实验方法
5.3 体外细胞毒性实验方法
5.4 抗水稻黄单胞菌的活体实验方法
5.5 植物毒性测试
5.6 实验结果讨论与分析
5.6.1 Ⅰ系列化合物的生物活性测试结果
5.6.2 Ⅱ系列化合物的生物活性测试
5.6.3 Ⅲ系列化合物的生物活性测试结果
5.7 Ⅲ系列抗水稻黄单胞菌的活体活性
5.7.1 200 mg/L浓度下Ⅲ_7和Ⅲ_8对水稻白叶枯病的活体治疗活性
5.7.2 200 mg/L浓度下Ⅲ_7和Ⅲ_8对水稻白叶枯病的活体保护活性
5.8 Ⅲ系列的植物毒性测试
5.9 Ⅲ系列的细胞毒性测试
5.10 本章小结
第六章 目标化合物的作用机制研究
6.1 Ⅲ系列化合物靶向FtsZ蛋白的作用机制研究
6.1.1 实验材料
6.1.2 化合物的GTPase活性实验
6.1.3 化合物对FtsZ的组装影响
6.1.4 化合物与XooFtsZ的解离常数的测定
6.1.5 化合物与FtsZ的圆二色谱研究
6.1.6 化合物与分子对接实验
6.1.7 细菌的形态学观察
6.1.8 化合物Ⅲ_7对XooFtsZ表达的影响
6.1.9 化合物Ⅲ_7对XooftsZ的mRNA相对表达量的影响
6.1.10 Ⅲ系列化合物链长对蛋白的潜在影响
6.2 Ⅰ系列和Ⅱ系列化合物靶向微管蛋白的作用机制研究
6.2.1 Ⅰ系列化合物靶向微管蛋白的作用机制研究
6.2.2 Ⅱ系列化合物靶向微管蛋白的作用机制研究
6.3 本章小结
第七章 基于天然产物的FtsZ抑制剂的筛选平台的建立
7.1 实验材料与方法
7.1.1 实验材料
7.2 实验结果
7.2.1 抗水稻黄单胞菌的活性测试
7.2.2 细菌的形态学观察
7.2.3 化合物对水稻黄单胞菌FtsZ的 GTPase活性初筛
7.2.4 鬼臼毒素类化合物的抑菌活性筛选
7.2.5 鬼臼毒素类化合物的形态学观察
7.2.6 化合物与XooFtsZ的分子对接模型
7.2.7 4’-去甲基表鬼臼毒素的时间-杀菌曲线
7.2.8 4’-去甲基表鬼臼毒素抗水稻白叶枯病的活体实验
7.2.9 细菌的形态学观察
7.3 本章小结
第八章 结论与展望
8.1 主要结果
8.2 创新点
8.3 不足之处
参考文献
致谢
附录
附件
本文编号：3735162
【文章页数】：262 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语列表
前言
第一章 文献综述
1.1 农药的发展简史
1.2 植物细菌性病害及研究现状
1.3 靶标研究的重要性
1.4 FtsZ抑制剂的研究现状
1.4.1 FtsZ蛋白的结构和功能
1.4.2 FtsZ的特点
1.4.3 作用于FtsZ蛋白的医药类小分子抑制剂
1.4.4 作用于微管蛋白的农药类小分子抑制剂
1.4.5 FtsZ蛋白与tubulin及其抑制剂的异同点
1.5 计算机辅助药物分子设计简要
1.5.1 同源模建(Homology modeling)
1.5.2 分子对接
1.6 本论文的立题思路与目的
1.6.1 研究目的及意义
1.6.2 研究方案
1.6.3 研究内容
第二章 同源模建与分子对接
2.1 FtsZ蛋白的同源模建
2.2 FtsZ蛋白与小分子的分子对接
2.2.1 受体预处理及原型分子生成
2.2.2 小分子配体的来源及准备
2.2.3 参数设置
2.2.4 结果与讨论
2.3 本章小结
第三章 目标化合物的合成
3.1 实验仪器与试剂
3.1.1 有机合成实验部分
3.1.2 生化实验部分
3.2 目标化合物的合成
3.2.1 Ⅰ系列N'-肉桂酰取代的肉桂酸酰肼衍生物的合成
3.2.2 Ⅱ系列(Z)-5-苯乙烯基罗丹宁-N-苯基乙酰胺类衍生物的合成
3.2.3 Ⅲ系列含(E)N’-肉桂酰基-3-(吡啶-3-基)丙烯酰肼结构的吡啶盐衍生物的合成
3.3 本章小结
第四章 靶向FtsZ蛋白的目标化合物的作用机制研究
4.1 实验材料
4.2 水稻黄单胞菌FtsZ蛋白克隆、表达和纯化
4.2.1 ftsZ基因的载体构建
4.2.2 重组质粒的转化
4.2.3 XooFtsZ蛋白的小试表达
4.2.4 表达菌的扩大培养
4.2.5 XooFtsZ蛋白的纯化
4.2.6 XooFtsZ蛋白的浓度测定
4.3 水稻黄单胞菌FtsZ的 GTPase活性实验条件筛选
4.3.1 标准曲线的绘制
4.3.2 FtsZ蛋白的酶活性实验条件筛选
4.4 水稻黄单胞菌FtsZ与小分子的相互作用实验
4.4.1 实验原理及数据分析方法
4.4.2 实验方法
4.5 水稻黄单胞菌FtsZ的自组装实验
4.6 水稻黄单胞菌FtsZ的二级结构变化
4.7 水稻黄单胞菌的形态学观察
4.8 本章小结
第五章 目标化合物的生物活性测试
5.1 抗植物病原细菌活性方法
5.2 体外抗肿瘤活性实验方法
5.3 体外细胞毒性实验方法
5.4 抗水稻黄单胞菌的活体实验方法
5.5 植物毒性测试
5.6 实验结果讨论与分析
5.6.1 Ⅰ系列化合物的生物活性测试结果
5.6.2 Ⅱ系列化合物的生物活性测试
5.6.3 Ⅲ系列化合物的生物活性测试结果
5.7 Ⅲ系列抗水稻黄单胞菌的活体活性
5.7.1 200 mg/L浓度下Ⅲ_7和Ⅲ_8对水稻白叶枯病的活体治疗活性
5.7.2 200 mg/L浓度下Ⅲ_7和Ⅲ_8对水稻白叶枯病的活体保护活性
5.8 Ⅲ系列的植物毒性测试
5.9 Ⅲ系列的细胞毒性测试
5.10 本章小结
第六章 目标化合物的作用机制研究
6.1 Ⅲ系列化合物靶向FtsZ蛋白的作用机制研究
6.1.1 实验材料
6.1.2 化合物的GTPase活性实验
6.1.3 化合物对FtsZ的组装影响
6.1.4 化合物与XooFtsZ的解离常数的测定
6.1.5 化合物与FtsZ的圆二色谱研究
6.1.6 化合物与分子对接实验
6.1.7 细菌的形态学观察
6.1.8 化合物Ⅲ_7对XooFtsZ表达的影响
6.1.9 化合物Ⅲ_7对XooftsZ的mRNA相对表达量的影响
6.1.10 Ⅲ系列化合物链长对蛋白的潜在影响
6.2 Ⅰ系列和Ⅱ系列化合物靶向微管蛋白的作用机制研究
6.2.1 Ⅰ系列化合物靶向微管蛋白的作用机制研究
6.2.2 Ⅱ系列化合物靶向微管蛋白的作用机制研究
6.3 本章小结
第七章 基于天然产物的FtsZ抑制剂的筛选平台的建立
7.1 实验材料与方法
7.1.1 实验材料
7.2 实验结果
7.2.1 抗水稻黄单胞菌的活性测试
7.2.2 细菌的形态学观察
7.2.3 化合物对水稻黄单胞菌FtsZ的 GTPase活性初筛
7.2.4 鬼臼毒素类化合物的抑菌活性筛选
7.2.5 鬼臼毒素类化合物的形态学观察
7.2.6 化合物与XooFtsZ的分子对接模型
7.2.7 4’-去甲基表鬼臼毒素的时间-杀菌曲线
7.2.8 4’-去甲基表鬼臼毒素抗水稻白叶枯病的活体实验
7.2.9 细菌的形态学观察
7.3 本章小结
第八章 结论与展望
8.1 主要结果
8.2 创新点
8.3 不足之处
参考文献
致谢
附录
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本文编号：3735162
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