福氏志贺菌酸性磷酸酶在合成稀有己酮糖中的应用
发布时间：2023-03-04 06:38
稀有己酮糖因具有抗肿瘤、抗炎、抗高血糖和免疫抑制作用等生理功能,在食品和制药行业中有广泛的应用前景。因此,建立一个高效、低廉的稀有己酮糖合成体系具有重要的意义。本论文将福氏志贺菌(Shigella flexneri)来源的酸性磷酸酶PhoN-Sf应用于稀有己酮糖合成体系,为稀有己酮糖的工业化生产提供理论依据。本论文的目的是建立以甘油为唯一碳源,通过多酶级联反应合成一系列稀有己酮糖的方法。磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶能够催化供体底物DHAP和受体底物D-/L-甘油醛(D-/L-GA)合成己酮糖-1-磷酸。首先,为了避免直接使用昂贵并且不稳定的DHAP,将酸性磷酸酶(PhoN-Sf)、甘油磷酸氧化酶(GPO)引入级联反应体系,以甘油为底物合成DHAP,分别利用三种DHAP依赖型醛缩酶:L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)、L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(Fuc A)和D-果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FruA)催化DHAP和外加的D-/L-GA合成相应的己酮糖-1-磷酸,同时PhoN-Sf催化己酮糖-1-磷酸脱磷酸得到稀有己酮糖。其次,为解决外加甘油醛问题,分别将醛醇氧化酶(A...
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 稀有糖概述
1.1.1 稀有己酮糖的生理功能
1.1.2 稀有己酮糖的合成方法
1.2 稀有己酮糖合成的相关酶
1.2.1 酸性磷酸酶
1.2.2 DHAP依赖型醛缩酶
1.2.3 甘油磷酸氧化酶
1.3“一釜多酶法”合成稀有己酮糖
1.4 全细胞催化技术
1.5 本论文研究意义和主要内容
1.5.1 本论文研究意义
1.5.2 本论文研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 质粒和菌株
2.1.2 酶、试剂和耗材
2.1.3 相关培养基、溶液配制
2.1.4 主要设备和仪器
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌感受态制备
2.2.2 大肠杆菌质粒化学转化
2.2.3 重组表达载体的构建
2.2.4 重组蛋白的表达和纯化
2.2.5 重组大肠杆菌的预处理
2.2.6 酶活检测
2.2.7 “一釜多酶法”合成稀有己酮糖体系构建
2.2.8 全细胞体系构建
2.2.9 纯酶体系的条件优化
2.2.10 全细胞体系的条件优化
2.2.11 利用重组ClearColi? BL21 (DE3)合成稀有己酮糖
2.2.12 稀有己酮糖含量检测
2.2.13 稀有己酮糖的分离和纯化
第三章 结果与讨论
3.1 以甘油和D/L-GA为底物“一釜多酶法”合成稀有己酮糖
3.1.1 磷酸酶PhoN-Sf在合成稀有己酮糖中的应用
3.1.2 醛缩酶和甘油磷酸氧化酶的表达与纯化
3.1.3“一釜多酶法”合成稀有己酮糖条件优化
3.2 以甘油为底物“一釜多酶法”合成稀有己酮糖
3.2.1 醛醇氧化酶AldO在合成稀有己酮糖中的应用
3.2.2 马肝醇脱氢酶和NADH氧化酶的表达与纯化
3.2.3 以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.3 全细胞体系在合成稀有己酮糖中的应用
3.3.1 全细胞体系中重组质粒的构建
3.3.2 全细胞体系中酶的表达和检测
3.3.3 全细胞体系的条件优化
3.3.4 全细胞体系的底物浓度优化
3.3.5 不同的质粒组合对全细胞反应体系的影响
3.3.6 全细胞合成稀有己酮糖最佳反应时长
3.3.7 分批流加对全细胞合成稀有己酮糖的影响
3.4 基于醛缩酶FucA/FruA的全细胞体系合成稀有己酮糖
3.4.1 基于醛缩酶FucA的全细胞体系合成稀有己酮糖
3.4.2 基于醛缩酶FruA的全细胞体系合成稀有己酮糖
3.5 仅以甘油为底物全细胞体系合成稀有己酮糖
3.5.1 基于醛缩酶RhaD使用双细胞以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.5.2 基于醛缩酶RhaD使用单细胞以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.5.3 基于醛缩酶FucA使用双细胞以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.6 利用重组ClearColi? BL21(DE3)合成稀有己酮糖
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录
附图:合成的稀有单糖的 1H NMR 图谱
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的文章
本文编号：3753896
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 稀有糖概述
1.1.1 稀有己酮糖的生理功能
1.1.2 稀有己酮糖的合成方法
1.2 稀有己酮糖合成的相关酶
1.2.1 酸性磷酸酶
1.2.2 DHAP依赖型醛缩酶
1.2.3 甘油磷酸氧化酶
1.3“一釜多酶法”合成稀有己酮糖
1.4 全细胞催化技术
1.5 本论文研究意义和主要内容
1.5.1 本论文研究意义
1.5.2 本论文研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 质粒和菌株
2.1.2 酶、试剂和耗材
2.1.3 相关培养基、溶液配制
2.1.4 主要设备和仪器
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌感受态制备
2.2.2 大肠杆菌质粒化学转化
2.2.3 重组表达载体的构建
2.2.4 重组蛋白的表达和纯化
2.2.5 重组大肠杆菌的预处理
2.2.6 酶活检测
2.2.7 “一釜多酶法”合成稀有己酮糖体系构建
2.2.8 全细胞体系构建
2.2.9 纯酶体系的条件优化
2.2.10 全细胞体系的条件优化
2.2.11 利用重组ClearColi? BL21 (DE3)合成稀有己酮糖
2.2.12 稀有己酮糖含量检测
2.2.13 稀有己酮糖的分离和纯化
第三章 结果与讨论
3.1 以甘油和D/L-GA为底物“一釜多酶法”合成稀有己酮糖
3.1.1 磷酸酶PhoN-Sf在合成稀有己酮糖中的应用
3.1.2 醛缩酶和甘油磷酸氧化酶的表达与纯化
3.1.3“一釜多酶法”合成稀有己酮糖条件优化
3.2 以甘油为底物“一釜多酶法”合成稀有己酮糖
3.2.1 醛醇氧化酶AldO在合成稀有己酮糖中的应用
3.2.2 马肝醇脱氢酶和NADH氧化酶的表达与纯化
3.2.3 以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.3 全细胞体系在合成稀有己酮糖中的应用
3.3.1 全细胞体系中重组质粒的构建
3.3.2 全细胞体系中酶的表达和检测
3.3.3 全细胞体系的条件优化
3.3.4 全细胞体系的底物浓度优化
3.3.5 不同的质粒组合对全细胞反应体系的影响
3.3.6 全细胞合成稀有己酮糖最佳反应时长
3.3.7 分批流加对全细胞合成稀有己酮糖的影响
3.4 基于醛缩酶FucA/FruA的全细胞体系合成稀有己酮糖
3.4.1 基于醛缩酶FucA的全细胞体系合成稀有己酮糖
3.4.2 基于醛缩酶FruA的全细胞体系合成稀有己酮糖
3.5 仅以甘油为底物全细胞体系合成稀有己酮糖
3.5.1 基于醛缩酶RhaD使用双细胞以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.5.2 基于醛缩酶RhaD使用单细胞以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.5.3 基于醛缩酶FucA使用双细胞以甘油为底物合成稀有己酮糖
3.6 利用重组ClearColi? BL21(DE3)合成稀有己酮糖
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录
附图:合成的稀有单糖的 1H NMR 图谱
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的文章
本文编号：3753896
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