基于结构信息学定向水解曲拉酪蛋白及新型降压肽的研究

发布时间：2023-03-05 01:51

　　高血压是导致心脑血管疾病的重要诱因,已经成为了全球性的公共健康问题。血管紧张素转化酶(Angiotensin-Ⅰ converting enzyme,ACE)在血压调节过程中起到了重要的作用。近年来,利用酶解食源性蛋白获取ACE抑制肽已经被广泛报道。通过多步分离纯化是目前发掘新型ACE抑制肽的常用策略。然而,该方法存在着分离成本高、耗时费力等缺点。随着越来越多ACE抑制肽的发现,其结构特征与抑制活性间的关系也逐步被阐明。因此,基于结构信息学快速筛选ACE抑制肽的策略有助于新型ACE抑制肽的开发利用。本研究以曲拉酪蛋白作为蛋白源,首先分析了曲拉酪蛋白作为制备生物活性肽的潜能。通过对曲拉酪蛋白氨基酸种类分析发现,其中疏水性氨基酸、碱性氨基酸和芳香族氨基酸占比分别为41.9%、12.1%和8.4%。该类氨基酸为ACE抑制肽结构中的优势氨基酸。然后研究分析了曲拉酪蛋白中生物活性肽的分布,发现其中包含大量ACE抑制肽片段,总ACE抑制肽出现频次(∑AACE inhibition)为2.1632,表明曲拉酪蛋白是产ACE抑制肽的良好蛋白源。研究继续利用模拟酶切分析了单酶(嗜热菌蛋白酶、碱性蛋白酶、...

【文章页数】：278 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 课题背景及研究目的和意义
    1.2 高血压概况
        1.2.1 血管紧张素转化酶
        1.2.2 ACE介导的血压调节系统
    1.3 ACE催化活性中心构效关系
        1.3.1 ACE催化活性中心
        1.3.2 ACE抑制肽构效关系
    1.4 酶法制备ACE抑制肽研究进展
        1.4.1 基于ACE构效关系蛋白酶的选择
        1.4.2 ACE抑制肽酶法制备研究进展
    1.5 基于构效关系ACE抑制肽的筛选
        1.5.1 计算机辅助模拟酶切
        1.5.2 定量构效关系模型
        1.5.3 分子对接技术
    1.6 ACE抑制肽生物利用度
    1.7 课题来源及主要研究内容
第2章 试验材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 主要原料
        2.1.2 主要仪器和设备
        2.1.3 主要生化试剂
    2.2 曲拉酪蛋白产ACE抑制肽潜能分析
        2.2.1 氨基酸序列检索
        2.2.2 氨基酸序列比对
        2.2.3 生物活性肽分布
        2.2.4 模拟酶切分析
        2.2.5 毒性分析
    2.3 水解物ACE抑制活性研究
        2.3.1 曲拉酪蛋白的制备
        2.3.2 蛋白含量的测定
        2.3.3 多肽含量的测定
        2.3.4 蛋白酶活力的测定
        2.3.5 单酶水解曲拉酪蛋白
        2.3.6 双酶水解曲拉酪蛋白
        2.3.7 水解度的测定
        2.3.8 Tricine-SDS-PAGE小分子凝胶电泳
        2.3.9 ACE抑制活性测定
        2.3.10 样品超滤分级
        2.3.11 ACE抑制动力学研究
    2.4 构效关系建立
        2.4.1 QSAR模型建立
        2.4.2 多肽指纹图谱分析
        2.4.3 空间分子对接
        2.4.4 固相合成
    2.5 降压及转运机制分析
        2.5.1 细胞培养
        2.5.2 细胞毒性测定
        2.5.3 NO含量测定
        2.5.4 eNOS磷酸化分析
        2.5.5 抗胃蛋白酶消化稳定性
        2.5.6 Caco-2细胞单层膜培养
        2.5.7 碱性磷酸酶活性测定
        2.5.8 ACE抑制肽转运机制研究
        2.5.9 体内降压活性测定
    2.6 数据处理与统计分析
第3章 曲拉酪蛋白产ACE抑制肽潜能研究
    3.1 引言
    3.2 曲拉酪蛋白分析
        3.2.1 曲拉酪蛋白与牛乳酪蛋白同源性分析
        3.2.2 曲拉酪蛋白氨基酸种类分析
        3.2.3 曲拉酪蛋白生物活性肽分布
    3.3 模拟酶切产ACE抑制肽分析
    3.4 复合酶模拟酶切分析
    3.5 本章小结
第4章 曲拉酪蛋白水解物ACE抑制活性研究
    4.1 引言
    4.2 蛋白酶酶活力的测定
    4.3 单酶水解曲拉酪蛋白水解物ACE抑制活性研究
        4.3.1 单酶水解物水解度测定
        4.3.2 Tricine-SDS-PAGE分析单酶水解物分子量分布
        4.3.3 单酶水解曲拉酪蛋白水解物ACE抑制活性
        4.3.4 不同组分水解物ACE抑制活性
        4.3.5 单酶水解液ACE抑制动力学分析
    4.4 双酶水解曲拉酪蛋白水解物ACE抑制活性研究
        4.4.1 双酶水解物水解度测定
        4.4.2 Tricine-SDS-PAGE分析双酶水解物分子量分布
        4.4.3 双酶水解曲拉酪蛋白水解物的ACE抑制活性
        4.4.4 双酶水解液ACE抑制动力学分析
    4.5 本章小结
第5章 基于构效关系筛选水解物中降压肽研究
    5.1 引言
    5.2 定量构效关系模型建立
    5.3 水解物多肽指纹图谱鉴定
    5.4 QSAR模型筛选ACE抑制活肽
        5.4.1 QSAR模型筛选单酶水解物中ACE抑制肽
        5.4.2 QSAR模型筛选双酶水解物中ACE抑制肽
    5.5 空间分子对接研究
        5.5.1 单酶水解物中潜在ACE抑制肽空间分子对接
        5.5.2 双酶水解物中潜在ACE抑制肽空间分子对接
    5.6 ACE抑制肽活性验证
    5.7 ACE抑制肽动力学分析
    5.8 本章小结
第6章 多肽KYIPIQ转运途径及降压作用研究
    6.1 引言
    6.2 多肽KYIPIQ对 HUVECs细胞毒性的测定
    6.3 多肽KYIPIQ对 HUVECs产胞内外NO的影响
    6.4 多肽KYIPIQ对 HUVECs的 e NOS磷酸化作用
    6.5 多肽KYIPIQ抗胃蛋白酶稳定性
    6.6 多肽吸收机制分析
        6.6.1 Caco-2细胞单层膜完整性分析
        6.6.2 多肽KYIPIQ对 Caco-2 细胞毒性的测定
        6.6.3 多肽KYIPIQ抗 Caco-2 细胞分泌酶稳定性研究
        6.6.4 多肽KYIPIQ跨 Caco-2 细胞单层膜的运输
        6.6.5 多肽KYIPIQ跨 Caco-2 细胞单层膜机制研究
    6.7 多肽KYIPIQ在 SHRs体内的降压效果
    6.8 本章小结
结论
创新点
展望
参考文献
附录一
附录二
附录三
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果
致谢
个人简历



本文编号：3755451