17β—羟基类固醇脱氢酶的功能鉴定及在合成宝丹酮中的应用
发布时间：2023-03-19 22:38
宝丹酮是一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇,可以稳定、持续地增长肌肉和力量,现在主要由1,4-雄烯二酮(1,4-Androstenedione,ADD)通过化学法合成。生物转化法与化学合成宝丹酮相比,具有转化条件温和,环境污染小,副产物少等优势。但由于合成宝丹酮的17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)很少被鉴定或者已被鉴定的17β-HSD不具有催化17β-还原反应的活性,导致了对酶的利用率较低,因此需要筛选具有更高活性的17β-羟基类固醇脱氢酶。本论文对多种不同来源的17β-HSD进行了分析和筛选,获得了具有较高17β-还原活性的重组酶HSDBo,在高效积累甾体药物中间体(ADD)的宿主中表达,以及构建了辅酶自循环体系,实现了从简单易得的原料植物甾醇到甾体激素药物宝丹酮的一步转化。(1)本研究首先对17β-羟基类固醇脱氢酶基因进行了筛选,根据其氨基酸序列,进行了同源性分析和序列比对。分别选取了来源于真菌和细菌的7种不同17β-HSD,在大肠杆菌中进行了异源表达。经SDS-PAGE验证,发现重组蛋白均可成功表达。进一步考察了各个重组17β-HSD对底物ADD的转化情况。发现重组酶HSD...
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 甾类化合物
1.1.1 甾类化合物概述
1.1.2 甾类物质的药用价值
1.2 甾体化合物的生化合成
1.2.1 甾体化合物合成的发展
1.2.2 微生物转化法合成甾体化合物
1.2.3 代谢甾体化合物的微生物
1.2.4 甾体药物宝丹酮的合成
1.3 17β-羟基类固醇脱氢酶
1.3.1 甾醇17β-羟基化反应概况
1.3.2 17β-羟基类固醇脱氢酶在甾体药物合成中的应用
1.4 辅酶NADPH再生体系的构建
1.4.1 辅酶NADPH再生的概述
1.4.2 辅酶再生系统的构建
1.5 论文研究内容
1.5.1 论文的立题背景及研究意义
1.5.2 论文主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 引物设计
2.1.3 常用试剂及其配置
2.1.4 主要仪器
2.1.5 培养基及培养条件
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌感受态的制备与转化
2.2.2 新金色分枝杆菌感受态的制备与转化
2.2.3 重组质粒的构建
2.2.4 17β-HSD在大肠杆菌中的表达和纯化
2.2.5 HSDBo和 G6PDH酶活性测定和部分酶学性质分析
2.2.6 胞内辅酶NADPH/NADP+水平测定
2.2.7 重组M.neoaurum JC-12 对植物甾醇的转化
2.2.8 5-L发酵罐中M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇生成宝丹酮的放大研究
2.2.9 分析方法
第三章 结果与讨论
3.1 17β-羟基类固醇脱氢酶的筛选
3.1.1 各17β-HSD的氨基酸序列同源性分析
3.1.2 重组菌BL21/p ET28a-HSD的构建
3.1.3 17β-羟基类固醇脱氢酶的异源表达及SDS-PAGE分析
3.1.4 各个重组酶对ADD的转化能力评估
3.2 17β-HSD的酶学性质分析及其辅酶的研究
3.2.1 重组酶HSDBo的纯化
3.2.2 重组酶HSDBo最适p H和最适温度的测定
3.2.3 金属离子对重组酶HSDBo活性的影响
3.2.4 HSDBo的辅酶依赖性鉴定
3.3 辅酶再生体系的构建
3.3.1 重组M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-GDHMn的构建
3.3.2 辅酶循环体系对重组新金色分枝杆菌合成宝丹酮及NADPH、NADP+含量的影响
3.4 优化转化条件提高宝丹酮的产量
3.4.1 助溶剂对重组菌发酵合成宝丹酮的影响
3.4.2 植物甾醇浓度对重组菌发酵生产宝丹酮的影响
3.4.3 葡萄糖对重组菌发酵生产宝丹酮的影响
3.4.4 重组菌M.neoaurum JC-12/pMV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇的生成宝丹酮的放大研究
主要结论及展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
本文编号：3766125
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 甾类化合物
1.1.1 甾类化合物概述
1.1.2 甾类物质的药用价值
1.2 甾体化合物的生化合成
1.2.1 甾体化合物合成的发展
1.2.2 微生物转化法合成甾体化合物
1.2.3 代谢甾体化合物的微生物
1.2.4 甾体药物宝丹酮的合成
1.3 17β-羟基类固醇脱氢酶
1.3.1 甾醇17β-羟基化反应概况
1.3.2 17β-羟基类固醇脱氢酶在甾体药物合成中的应用
1.4 辅酶NADPH再生体系的构建
1.4.1 辅酶NADPH再生的概述
1.4.2 辅酶再生系统的构建
1.5 论文研究内容
1.5.1 论文的立题背景及研究意义
1.5.2 论文主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 引物设计
2.1.3 常用试剂及其配置
2.1.4 主要仪器
2.1.5 培养基及培养条件
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌感受态的制备与转化
2.2.2 新金色分枝杆菌感受态的制备与转化
2.2.3 重组质粒的构建
2.2.4 17β-HSD在大肠杆菌中的表达和纯化
2.2.5 HSDBo和 G6PDH酶活性测定和部分酶学性质分析
2.2.6 胞内辅酶NADPH/NADP+水平测定
2.2.7 重组M.neoaurum JC-12 对植物甾醇的转化
2.2.8 5-L发酵罐中M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇生成宝丹酮的放大研究
2.2.9 分析方法
第三章 结果与讨论
3.1 17β-羟基类固醇脱氢酶的筛选
3.1.1 各17β-HSD的氨基酸序列同源性分析
3.1.2 重组菌BL21/p ET28a-HSD的构建
3.1.3 17β-羟基类固醇脱氢酶的异源表达及SDS-PAGE分析
3.1.4 各个重组酶对ADD的转化能力评估
3.2 17β-HSD的酶学性质分析及其辅酶的研究
3.2.1 重组酶HSDBo的纯化
3.2.2 重组酶HSDBo最适p H和最适温度的测定
3.2.3 金属离子对重组酶HSDBo活性的影响
3.2.4 HSDBo的辅酶依赖性鉴定
3.3 辅酶再生体系的构建
3.3.1 重组M.neoaurum JC-12/p MV261-HSDBo-GDHMn的构建
3.3.2 辅酶循环体系对重组新金色分枝杆菌合成宝丹酮及NADPH、NADP+含量的影响
3.4 优化转化条件提高宝丹酮的产量
3.4.1 助溶剂对重组菌发酵合成宝丹酮的影响
3.4.2 植物甾醇浓度对重组菌发酵生产宝丹酮的影响
3.4.3 葡萄糖对重组菌发酵生产宝丹酮的影响
3.4.4 重组菌M.neoaurum JC-12/pMV261-HSDBo-G6PDHmn催化植物甾醇的生成宝丹酮的放大研究
主要结论及展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
本文编号：3766125
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3766125.html
