利用异源表达策略激活海生哈茨木霉中两个生物合成基因簇

发布时间：2023-03-24 03:15

　　真菌的次级代谢产物是新药和先导化合物的重要来源,然而随着越来越多的化合物被重复发现,真菌来源的天然产物发掘逐渐到了瓶颈期。与分散在整个真菌基因组中的初级代谢物合成所需的基因相反,编码活性酶以产生次级代谢物的基因常以连续的方式排列为生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)。随着基因组测序技术的成熟和生物信息学分析方法的完善,研究人员发现真菌的BGCs十分丰富,然而由于实验室培养条件的限制,超过70%的生物合成基因簇处于沉默或未开发状态,表明真菌天然产物的发掘还有很大的空间。因此,如何激活这些沉默基因簇成为真菌天然产物研究的关键。本文选择丝状真菌海生哈茨木霉Trichoderma harzianum LZDX-32-08 为研究对象,利用构巢曲霉Aspergillus nzdulans A1145 及 LO8030 作为异源表达宿主,对 T.harzianum LZDX-32-08中沉默或低表达的生物合成基因簇进行探究。本文通过在A.nidulans A1145及LO8030中构建异源表达系统,发现空质粒pQFl(含AMA1序列)的引入使得构巢曲霉的...

【文章页数】：103 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
缩略词与符号说明
第一章 绪论
    1.1 真菌来源天然产物的发展及现状
        1.1.1 重要真菌活性天然产物类型及基因簇
            1.1.1.1 聚酮类
            1.1.1.2 萜类
            1.1.1.3 非核糖体多肽类
        1.1.2 核苷类化合物虫草素的发展及现状
    1.2 哈茨木霉的研究现状
        1.2.1 哈茨木霉的生物防治功能
        1.2.2 哈茨木霉的天然产物研究
    1.3 异源表达体系在真菌天然产物研究中的应用
        1.3.1 异源表达激活沉默基因(簇)的策略
        1.3.2 酵母组装技术的研究进展
        1.3.3 质粒构建中AMA1序列的使用
    1.4. 本课题的研究目的及意义
第二章 哈茨木霉聚酮类及萜类天然产物生物合成基因簇的研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料及仪器
        2.2.1 菌株
        2.2.2 实验材料及试剂
        2.2.3 实验仪器及设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 全基因组测序
        2.3.2 反转录PCR
            2.3.2.1 RNA的提取
            2.3.2.2 反转录cDNA
            2.3.2.3 PCR验证
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 Trichoderma harzianum生物合成基因簇的预测及分析
        2.4.2 海生T.harzianum LZDX-32-08基因组测序结果的分析
        2.4.3 验证目标产物在初始菌株海生T.harzianum中的表达
            2.4.3.1 基因簇核心基因在菌株中的表达情况
            2.4.3.2 发酵结果验证两个基因簇的沉默
    2.5 小结
第三章 空白质粒对构巢曲霉合成虫草素的影响
    3.1 引言
    3.2 实验材料及仪器
        3.2.1 质粒及菌株
        3.2.2 实验材料及试剂
        3.2.3 实验仪器及设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 溶液及培养基配制
        3.3.2 Aspergillus nidulans原生质体制备及转化
        3.3.3 初始菌株及转化子基因组(gDNA)提取
        3.3.4 产物的分离与鉴定
            3.3.4.1 硅胶柱层析
            3.3.4.2 半制备液相色谱分离
            3.3.4.3 核磁共振(NMR)
            3.3.4.4 UPLC及LC-MS检测
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 Aspergillus nidulans空质粒转化子的构建
        3.4.2 虫草素结构的鉴定
        3.4.3 虫草素合成基因的表达验证
        3.4.4 虫草素合成的时间依赖性
        3.4.5 空白质粒对虫草素产量的提高
    3.5 小结
第四章 生物合成基因簇异源表达菌株的构建
    4.1 引言
    4.2 实验材料及仪器
        4.2.1 质粒及菌株
        4.2.2 实验材料及试剂
        4.2.3 实验仪器及设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 PCR体系、条件及产物纯化
        4.3.2 酿酒酵母转化子构建及筛选
        4.3.3 培养基配制
        4.3.4 大肠杆菌感受态制备及转化
        4.3.5 质粒提取及限制性内切酶酶切验证
        4.3.6 原生质体制备、转化及转化子验证
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 重组质粒的构建及验证
            4.4.4.1 PKS cluster8基因片段的克隆
            4.4.4.2 terpene cluster26基因片段的克隆
            4.4.4.3 质粒的验证和线性化
            4.4.4.4 酵母转化子筛选结果
            4.4.4.5 质粒酶切验证结果
        4.4.2 A.nidulans A1145构巢曲霉异源表达菌株的构建及验证
            4.4.2.1 A1145转化子PCR验证
            4.4.2.2 RT-PCR验证
        4.4.3 A.nidulans L08030构巢曲霉异源表达菌株的验证
    4.5 小结
第五章 异源表达产物的激活
    5.1 引言
    5.2 实验材料及仪器
        5.2.1 菌株
        5.2.2 实验材料及试剂
        5.2.3 实验仪器及设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 发酵培养基配置
        5.3.2 孢子收集及发酵接种
        5.3.3 UPLC样品准备
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 探究A.nidulans A1145及L08030 PKS C8转化子的培养条件
            5.4.1.1 A.nidulans A1145 PKS转化子PM13培养基发酵结果
            5.4.1.2 A.nidulans A1145 PKS转化子PM14培养基发酵结果
            5.4.1.3 A.nidulans L08030 PKS转化子CD-ST培养基发酵结果
        5.4.2 探究A.nidulans A1145及L08030 terpene C26转化子的培养条件
            5.4.2.1 A.nidulans A1145及terpene转化子PM13培养基发酵结果
            5.4.2.2 A.nidulans A1145及terpene转化子CD-ST培养基发酵结果
            5.4.2.3 A.nidulans L08030及terpene转化子CD-ST培养基发酵结果
    5.5 小结
第六章 结论与建议
    6.1 结论
    6.2 研究特色及创新点
    6.3 建议
参考文献
附录
    1. 系统发生树
    2. 引物列表
    3. 核磁图谱
    4. LC-MS图谱
致谢
研究成果及发表的学术论文
作者及导师简介
附件



本文编号：3769331