高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的筛选鉴定及功能探究

发布时间：2023-05-31 23:27

　　多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)具有多种重要的生物学功能,动、植物中的PUFAs以18碳链长以下的脂肪酸为主,而20碳链长以上的脂肪酸可由某些产油微生物提供。高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种脂质含量可达自身干重50%以上的产油丝状真菌,能合成多种高附加值的PUFAs,目前已经是工业化生产花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)的主要菌株。二酰甘油酰基转移酶是三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)合成途径中的关键限速酶,在不同物种中对其进行遗传改造发现其能显著影响TAG含量和组成。因为高山被孢霉中脂肪酸主要以TAG形式积累且AA含量高达总脂肪酸的30%⁴0%,其二酰甘油酰基转移酶可能在这方面起到重要作用。本课题以高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶为研究对象,筛选高山被孢霉中的二酰甘油酰基转移酶编码基因,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中异源表达进行功能鉴定,将能增强脂质积累的基因在高山被孢霉中进行过表达,探索其对高山被孢霉脂质积累的影响,为提...

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
1 绪论
    1.1 多不饱和脂肪酸与微生物油脂概述
        1.1.1 多不饱和脂肪酸
        1.1.2 产油微生物及微生物油脂
        1.1.3 高山被孢霉简介
    1.2 微生物中三酰甘油合成途径
        1.2.1 甘油-3-磷酸途径
        1.2.2 相关酶的功能
    1.3 二酰甘油酰基转移酶的研究背景
        1.3.1 二酰甘油酰基转移酶的结构和分类
        1.3.2 二酰甘油酰基转移酶的功能和应用
        1.3.3 高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的研究进展
    1.4 立题依据和主要研究内容
        1.4.1 立题依据
        1.4.2 主要研究内容
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株及质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要试剂配制方法
        2.1.5 培养基及其配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株的培养与保藏
        2.2.2 高山被孢霉中目的基因的筛选与生物信息学分析
        2.2.3 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶的克隆及异源表达载体的构建
        2.2.4 PEG/LiAc法构建酿酒酵母重组菌
        2.2.5 酿酒酵母重组菌中异源蛋白表达水平
        2.2.6 外加底物后酿酒酵母转化子中异源蛋白的催化选择性
        2.2.7 酿酒酵母重组菌产脂情况
        2.2.8 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶的克隆及同源过表达载体的构建
        2.2.9 利用根癌农杆菌介导法过表达高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶
        2.2.10 高山被孢霉重组菌株的筛选及验证
        2.2.11 高山被孢霉重组菌生长及产脂情况
        2.2.12 数据处理及分析方法
3 结果与讨论
    3.1 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶的筛选和生物学信息分析
        3.1.1 同源性及保守域分析
        3.1.2 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶蛋白结构分析
        3.1.3 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶原始转录水平分析
    3.2 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶功能验证
        3.2.1 酿酒酵母重组菌的构建和筛选验证
        3.2.2 酿酒酵母重组菌中异源蛋白表达水平测定
        3.2.3 酿酒酵母重组菌产脂情况分析
        3.2.4 酿酒酵母重组菌中二酰甘油酰基转移酶催化选择性分析
    3.3 高山被孢霉重组菌株的构建和功能验证
        3.3.1 二元表达载体构建
        3.3.2 高山被孢霉重组菌株的筛选及鉴定
        3.3.3 高山被孢霉重组菌生长和产脂分析
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录 Ⅰ：作者在攻读硕士学位期间发表的文章
附录 Ⅱ：材料与方法中附表
附录 Ⅲ：部分气相色谱峰图



本文编号：3826215