改造毕赤酵母提高谷胱甘肽的合成效率

发布时间：2023-06-16 21:19

　　谷胱甘肽(glutathione,GSH)因其具有良好的营养价值、抗氧化性和解毒功能而被广泛运用于食品、化妆品和医药行业。目前生产谷胱甘肽最主要的方法是微生物发酵法。与传统的化学合成法和酶法相比,该方法具有生产成本低、操作简单、无需外源添加ATP和辅助因子等优势。重组毕赤酵母(Pichia pastoris)由于蛋白表达量高、易实现高密度培养等优点,已初步显示出在工业上生产谷胱甘肽的价值。本研究以异源表达来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c的谷胱甘肽酶基因(gsh1和gsh2)的重组毕赤酵母GS115为出发菌株,从诱变育种、拷贝数的筛选、产物分解代谢途径的改造、外源基因的整合和摇瓶发酵条件的优化这些方面来提高产物谷胱甘肽的合成效率。主要研究内容及结论如下:(1)将重组毕赤酵母GS115进行紫外和甲基磺酸乙酯复合诱变,以谷胱甘肽类似物乙硫氨酸作为筛选剂。将紫外诱变的时间设置为40 s,甲基磺酸乙酯诱变剂的浓度为0.4 mg·mL^-1,乙硫氨酸筛选剂的浓度为0.8 g·L^-1,筛选后获得一株稳定遗传的正向突...

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 谷胱甘肽概述
        1.1.1 谷胱甘肽
        1.1.2 谷胱甘肽的生理功能
        1.1.3 谷胱甘肽的应用
    1.2 谷胱甘肽的主要生产方法及现状
        1.2.1 提取法
        1.2.2 化学合成法
        1.2.3 酶法合成
        1.2.4 发酵法
    1.3 表达宿主
    1.4 本课题的立题依据和研究意义
    1.5 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 培养基
        2.1.5 流动相与缓冲液
    2.2 方法
        2.2.1 分子生物学操作方法
        2.2.2 谷胱甘肽的检测
        2.2.3 菌体培养方法
        2.2.4 诱变及筛选方法
        2.2.5 表达载体的构建与高拷贝基因的筛选
        2.2.6 CRISPR/Cas9敲除dug基因的方法
        2.2.7 质粒vgb的构建和表达方法
        2.2.8 发酵优化方法
第三章 结果与讨论
    3.1 高产谷胱甘肽毕赤酵母的选育
        3.1.1 诱变方法和剂量的确定
        3.1.2 高产菌株的筛选
        3.1.3 突变株传代稳定性验证
        3.1.4 突变菌株与原始菌株的特性研究
    3.2 谷胱甘肽合成酶GSH1和GSH2 的过表达
        3.2.1 gsh1和gsh2 过表达菌株的构建和验证
        3.2.2 具有高拷贝基因(gsh1和gsh2)毕赤酵母的筛选
        3.2.3 过表达gsh1和gsh2 基因对毕赤酵母生长和产谷胱甘肽的影响
    3.3 毕赤酵母中谷胱甘肽降解途径(Dug途径)相关酶基因的敲除
        3.3.1 Dug敲除菌株的构建和分子鉴定
        3.3.2 敲除dug酶基因对毕赤酵母中谷胱甘肽产量的影响
    3.4 透明颤菌血红蛋白(VHb)在产谷胱甘肽毕赤酵母中的表达
        3.4.1 表达VHb的毕赤酵母工程菌株的构建
        3.4.2 CO差视光谱法检测透明颤菌血红蛋白的活性
        3.4.3 表达VHb对毕赤酵母生长和产谷胱甘肽的影响
    3.5 毕赤酵母生产谷胱甘肽发酵条件的优化
        3.5.1 发酵培养基中三种前体氨基酸初始添加量的优化
        3.5.2 接种量的优化
        3.5.3 补料时间点和补料量的优化
        3.5.4 发酵温度的优化
主要结果与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3834004