亚基融合型腈水合酶的构建及成熟机制研究

发布时间：2023-09-16 19:29

　　腈水合酶(Nitrile hydratase,简称NHase;EC:4.2.1.84)能够催化腈在常温中性条件下与水化合形成酰胺,是替代高温强酸催化工艺实现酰胺类大宗化学品绿色制造的关键酶种。常见NHase是含?和?亚基的金属酶,酶的成熟遵循亚基自身交换机制。但酶的热稳定性和有机溶剂耐受性较差,难以满足工业化生产对酶学性质的应用要求。因此,亟需发掘新型NHase,改良酶的催化性能。本研究依据新发现的领鞭毛虫(Monosiga brevicollis)单肽链腈水合酶的蛋白结构特点,对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida 5B/NRRL-18668)腈水合酶进行亚基融合重构,大幅提高腈水合酶的热稳定性和产物耐受性;又研究了来源于P.putida 5B和玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)的腈水合酶亚基融合突变体的活化机理,揭示了调控蛋白对于融合型腈水合酶的激活机制。主要研究结果如下:(1)对P.putida 5B来源的腈水合酶PpNHase进行亚基融合重构,获得了活性和稳定性均大幅提高的亚基融合型腈水合酶。基于M.brevicollis单链腈水...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 腈类化合物
        1.1.1 腈类化合物的作用
        1.1.2 腈类的微生物转化
    1.2 腈水合酶
        1.2.1 腈水合酶
        1.2.2 腈水合酶的催化机理
        1.2.3 腈水合酶的来源及基因结构
    1.3 翻译后修饰
        1.3.1 亚基自身交换
        1.3.2 金属伴随子
    1.4 腈水合酶的工业应用
    1.5 腈水合酶的改造
        1.5.1 腈水合酶生产存在的问题
        1.5.2 大肠杆菌的异源表达
        1.5.3 腈水合酶稳定性改造策略
    1.6 本文研究内容
        1.6.1 立题依据及研究意义
        1.6.2 本文主要研究内容
第二章 亚基融合型腈水合酶的构建
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 菌株与载体
        2.2.2 实验试剂
        2.2.3 实验仪器
        2.2.4 培养基及培养条件
        2.2.5 基因操作
        2.2.6 蛋白表达及纯化
        2.2.7 酶活测定
        2.2.8 钴含量测定
        2.2.9 最适pH测定
        2.2.10 热稳定性测定
        2.2.11 产物耐受性测定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 融合型腈水合酶的构建及表达
        2.3.2 融合型腈水合酶的表征
        2.3.3 调控蛋白融合位置的影响
        2.3.4 融合型腈水合酶的理化性质测定
    2.4 本章小结
第三章 融合型腈水合酶的热稳定性改造
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 菌株质粒
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 培养基及培养条件
        3.2.4 基因操作
        3.2.5 蛋白表达及纯化
        3.2.6 酶活及动力学参数测定
        3.2.7 动力学及热力学稳定性测定
        3.2.8 同源建模
        3.2.9 计算模拟
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 融合型腈水合酶的同源建模
        3.3.2 融合型腈水合酶突变体库的构建
        3.3.3 突变体的筛选
        3.3.4 正向突变体的酶学表征
        3.3.5 正向突变体的结构分析
        3.3.6 正向突变体分子间相互作用探究
    3.4 本章小结
第四章 融合型腈水合酶成熟机理探究
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 菌株与载体
        4.2.2 实验仪器
        4.2.3 蛋白表达与纯化
        4.2.4 腈水合酶的体外激活
        4.2.5 紫外-可见光扫描
        4.2.6 基于NanoLC-ESI-MS/MS的半胱氨酸氧化状态测定
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 融合型腈水合酶的体外激活
        4.3.2 腈水合酶的紫外—可见光光谱扫描
        4.3.3 融合型腈水合酶活性中心的翻译后修饰分析
        4.3.4 融合型腈水合酶成熟机理
    4.4 本章小结
第五章 调控蛋白的金属伴随子功能探究
    5.1 前言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 菌株与载体
        5.2.2 实验仪器
        5.2.3 质粒构建
        5.2.4 蛋白表达与纯化
        5.2.5 酶活与动力学参数测定
        5.2.6 钴离子的光谱扫描及含量测定
        5.2.7 钴离子与调控蛋白的结合
        5.2.8 测定调控蛋白与腈水合酶的结合
        5.2.9 从头建模及分子动力学模拟
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 调控蛋白对融合型腈水合酶活性的影响
        5.3.2 单独调控蛋白的获取
        5.3.3 单独调控蛋白的表征
        5.3.4 单独调控蛋白对融合型腈水合酶的体外激活
        5.3.5 异源调控蛋白对融合型腈水合酶的体内激活
        5.3.6 钴离子与调控蛋白体外结合的分析
        5.3.7 调控蛋白与脱辅基酶的结合分析
        5.3.8 调控蛋白模型的建立及动力学分析
        5.3.9 调控蛋白钴离子结合位点的分析
        5.3.10 金属伴随子激活模型
    5.4 本章小结
第六章 天然融合型腈水合酶成熟机理探究
    6.1 前言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 菌株与载体
        6.2.2 培养条件
        6.2.3 基因合成及密码子优化
        6.2.4 包涵体的检测
        6.2.5 蛋白表达与纯化
        6.2.6 酶活及热稳定性测定
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的异源表达
        6.3.2 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的表达优化
        6.3.3 M.brevicollis天然融合型腈水合酶的活性及热稳定性
        6.3.4 异源调控蛋白对M.brevicollis天然融合型腈水合酶的激活
    6.4 本章小结
主要结论与展望
    主要结论
    展望
论文创新点
致谢
参考文献
附录 ：作者在攻读博士期间发表的论文



本文编号：3847062