基于基因组分析的酮古龙酸菌高效生产2-KGA代谢途径的构建
发布时间：2023-09-28 22:12
2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)作为维生素C的前体,工业上由L-山梨糖在酮古龙酸菌及芽孢杆菌组成的混菌发酵体系转化获得。虽然经过多年的菌种优化,但是各工业菌种生产2-KGA的能力提高不显著,其代谢途径尚不完全清楚。本文对实验室现有的两株酮古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare SPUB805(需要Bacillus megatherium SPUB806伴生共发酵)及Ketogulonigenium robustum SPUB003(可独立发酵)进行了全基因组测序,并与已报道的需要伴生发酵的四个菌株(K.vulgare WSH-001、K.luare Y25、K.vulgare Hbe602及K.vulgare SKV)进行比较基因组学分析,以揭示生长模式及产量不同的机制。K.vulgare SPUB805只含有一个环状的基因组,没有质粒,缺失葡萄糖酸2-脱氢酶(分解2-KGA,GA2DH)基因、山梨酮脱氢酶(转化山梨酮为2-KGA,SNDH)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩...
【文章页数】：168 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语简表
第一章 前言
1.1 大宗发酵
1.2 典型大宗发酵产品的生物合成基因改造
1.2.1 氨基酸
1.2.2 生物燃料
1.2.3 有机酸
1.2.4 维生素
1.3 维生素C发酵
1.3.1 添加外源物质
1.3.2 分子生物学研究
1.3.3 组学研究
1.4 启动子研究
1.4.1 启动子的结构
1.4.2 启动子工程策略
1.5 代谢途径的研究
1.5.1 经典代谢途径
1.5.2 磷酸转酮酶途径
1.6 立题依据
第二章 酮古龙酸菌基因组分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株
2.1.2 培养基及试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 发酵检测
2.2.2 全基因组测序
2.2.3 基因组注释
2.2.4 代谢途径分析
2.3 实验结果
2.3.1 K.vulgare SPUB805基因组分析
2.3.2 K.robustum SPUB003基因组分析
2.3.3 K.vulgare种内比较基因组分析
2.3.4 Ketogulonigenium种间比较基因组分析
2.4 小结
2.5 讨论
第三章 K.robustum SPUB003启动子的研究
3.1 实验材料
3.1.1 菌株及质粒
3.1.2 引物
3.1.3 培养基及试剂
3.1.4 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 启动子预测
3.2.2 启动子活性检测质粒构建流程
3.2.3 基因操作
3.2.4 荧光检测
3.3 实验结果
3.3.1 启动子预测结果
3.3.2 含启动子的质粒构建结果
3.3.3 启动子活性结果
3.4 小结
3.5 讨论
第四章 XFP-PTA糖代谢途径在酮古龙酸菌中的构建
4.1 实验材料
4.1.1 菌株及质粒
4.1.2 引物
4.1.3 培养基及试剂
4.1.4 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 重组质粒构建流程
4.2.2 外源基因的诱导表达
4.2.3 SDS-PAGE检测蛋白表达
4.2.4 蛋白纯化与透析
4.2.5 蛋白含量检测
4.2.6 乙酰磷酸标准曲线绘制
4.2.7 磷酸转酮酶酶活检测
4.2.8 磷酸转乙酰酶酶活检测
4.2.9 乙酰辅酶A含量检测
4.2.10 RNA提取及完整性检测
4.2.11 cDNA的合成
4.2.12 RT-qPCR
4.3 实验结果
4.3.1 xfp体外表达
4.3.2 pta体外表达
4.3.3 密码子的优化
4.3.4 XFP-PTA代谢途径构建
4.3.5 XFP体内活性检测
4.3.6 PTA体内活性检测
4.3.7 乙酰辅酶A含量检测
4.3.8 重组菌的生长曲线
4.3.9 重组菌的2-酮基-L-古龙酸含量检测
4.3.10 重组菌部分基因转录水平检测
4.4 小结
4.5 讨论
全文总结
全文讨论
创新点
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢
附录
本文编号：3848709
【文章页数】：168 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语简表
第一章 前言
1.1 大宗发酵
1.2 典型大宗发酵产品的生物合成基因改造
1.2.1 氨基酸
1.2.2 生物燃料
1.2.3 有机酸
1.2.4 维生素
1.3 维生素C发酵
1.3.1 添加外源物质
1.3.2 分子生物学研究
1.3.3 组学研究
1.4 启动子研究
1.4.1 启动子的结构
1.4.2 启动子工程策略
1.5 代谢途径的研究
1.5.1 经典代谢途径
1.5.2 磷酸转酮酶途径
1.6 立题依据
第二章 酮古龙酸菌基因组分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验菌株
2.1.2 培养基及试剂
2.1.3 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 发酵检测
2.2.2 全基因组测序
2.2.3 基因组注释
2.2.4 代谢途径分析
2.3 实验结果
2.3.1 K.vulgare SPUB805基因组分析
2.3.2 K.robustum SPUB003基因组分析
2.3.3 K.vulgare种内比较基因组分析
2.3.4 Ketogulonigenium种间比较基因组分析
2.4 小结
2.5 讨论
第三章 K.robustum SPUB003启动子的研究
3.1 实验材料
3.1.1 菌株及质粒
3.1.2 引物
3.1.3 培养基及试剂
3.1.4 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 启动子预测
3.2.2 启动子活性检测质粒构建流程
3.2.3 基因操作
3.2.4 荧光检测
3.3 实验结果
3.3.1 启动子预测结果
3.3.2 含启动子的质粒构建结果
3.3.3 启动子活性结果
3.4 小结
3.5 讨论
第四章 XFP-PTA糖代谢途径在酮古龙酸菌中的构建
4.1 实验材料
4.1.1 菌株及质粒
4.1.2 引物
4.1.3 培养基及试剂
4.1.4 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 重组质粒构建流程
4.2.2 外源基因的诱导表达
4.2.3 SDS-PAGE检测蛋白表达
4.2.4 蛋白纯化与透析
4.2.5 蛋白含量检测
4.2.6 乙酰磷酸标准曲线绘制
4.2.7 磷酸转酮酶酶活检测
4.2.8 磷酸转乙酰酶酶活检测
4.2.9 乙酰辅酶A含量检测
4.2.10 RNA提取及完整性检测
4.2.11 cDNA的合成
4.2.12 RT-qPCR
4.3 实验结果
4.3.1 xfp体外表达
4.3.2 pta体外表达
4.3.3 密码子的优化
4.3.4 XFP-PTA代谢途径构建
4.3.5 XFP体内活性检测
4.3.6 PTA体内活性检测
4.3.7 乙酰辅酶A含量检测
4.3.8 重组菌的生长曲线
4.3.9 重组菌的2-酮基-L-古龙酸含量检测
4.3.10 重组菌部分基因转录水平检测
4.4 小结
4.5 讨论
全文总结
全文讨论
创新点
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢
附录
本文编号：3848709
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