Variovorax paradoxus S110细胞色素P450：CYP116B256v2的异源表达及催化特性研究
发布时间：2023-10-02 01:36
细胞色素P450单加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases)是一种广泛存在于自然界中的亚铁血红素–硫醇盐蛋白超家族,可催化羟基化、环氧化和O-脱烷基等多种类型的反应,特别是其可以在温和条件下,催化复杂化合物中惰性C-H键的区域和立体选择性氧化反应,从而实现传统化学反应难以实现的各类合成反应,因而其在有机合成,药物合成等方面具有很高的应用价值。为丰富P450酶作为合成生物学的酶元件库、探索新型催化反应进一步提高P450酶的应用价值,本研究利用生物信息学手段挖掘到来自两种不同菌株(Sphingomonas wittichii RW1和Variovorax paradoxus S110)的细胞色素P450单加氧酶并对它们进行异源表达和催化特性分析,主要研究结果如下:分别对这两种不同来源的P450酶进行异源表达,发现只有来源于Variovorax paradoxus S110菌株中的P450酶能在大肠杆菌中实现异源可溶表达,以下称之为P450VpMO。对其氨基酸序列进行分析并与其他已报道的P450家族蛋白氨基酸序列比对发现该酶属于P450酶CY...
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 P450酶概述
1.1.1 P450酶的来源及命名
1.1.2 P450酶分类
1.2 P450酶的催化反应机制以及反应类型
1.2.1 P450酶的催化反应机制
1.2.2 P450酶的催化反应类型
1.3 P450酶的功能
1.4 P450酶的应用
1.4.1 P450酶在医药中应用
1.4.2 P450酶与环境污染物
1.4.3 P450酶在农业中应用
1.4.4 P450酶在实际应用中遇到问题
1.5 CYP116B家族P450酶的研究现状
1.6 Variovorax sp.功能简介
1.6.1 有机硫化合物代谢与Variovorax sp.
1.6.2 除草剂代谢与Variovorax sp.
1.6.3 工业污染物代谢与Variovorax sp.
1.6.4 Variovorax sp.与P450酶
1.7 本论文立题依据以及研究内容
1.7.1 立题依据
1.7.2 本论文的主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种与质粒
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 主要实验试剂及来源
2.1.4 主要培养基
2.2 分析方法
2.2.1 菌体浓度测定方法
2.2.2 蛋白浓度测定方法
2.2.3 光谱学性质测定方法(一氧化碳示差法)
2.2.4 P450VpMO酶活力的测定
2.2.5 SDS-PAGE检测分析方法
2.3 实验方法
2.3.1 P450VpMO目的基因与表达载体的克隆及酶连
2.3.2 胶回收方法
2.3.3 大肠杆菌Top10 以及BL21(DE3)感受态细胞制备与质粒转化
2.3.4 菌液PCR验证以及质粒抽提方法
2.3.5 目的蛋白表达与纯化方法
2.3.6 蛋白的浓缩
2.3.7 镍柱的重生
2.3.8 酶学性质的测定
2.3.9 重组P450VpMO底物谱测试
第三章 结果与讨论
3.1 质粒构建与蛋白表达纯化
3.1.1 P450spwi01与P450Vp MO的质粒构建及蛋白表达纯化
3.1.2 P450VpMO质粒构建及蛋白表达纯化
3.2 重组P450VpMO光谱学性质的鉴定
3.3 重组P450VpMO系统进化树的构建
3.4 重组P450VpMO酶学性质测定
3.4.1 p H与温度对重组P450Vp MO酶活力的影响
3.4.2 重组P450VpMO温度稳定性
3.4.3 重组P450VpMO动力学参数测定
3.5 重组P450VpMO的底物谱探索
3.5.1 重组P450VpMO对硫醚类物质的氧化
3.5.2 重组P450VpMO对苯乙烯的催化
3.5.3 重组P450VpMO羟基化作用
3.5.4 重组P450Vp MO O-脱烷基反应
3.5.5 重组P450VpMO对苯胺类物质反应测试
3.5.6 重组P450VpMO对抗生素的降解测试
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录1 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附录2 :本文中相关反应的液相色谱图
本文编号：3849840
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 P450酶概述
1.1.1 P450酶的来源及命名
1.1.2 P450酶分类
1.2 P450酶的催化反应机制以及反应类型
1.2.1 P450酶的催化反应机制
1.2.2 P450酶的催化反应类型
1.3 P450酶的功能
1.4 P450酶的应用
1.4.1 P450酶在医药中应用
1.4.2 P450酶与环境污染物
1.4.3 P450酶在农业中应用
1.4.4 P450酶在实际应用中遇到问题
1.5 CYP116B家族P450酶的研究现状
1.6 Variovorax sp.功能简介
1.6.1 有机硫化合物代谢与Variovorax sp.
1.6.2 除草剂代谢与Variovorax sp.
1.6.3 工业污染物代谢与Variovorax sp.
1.6.4 Variovorax sp.与P450酶
1.7 本论文立题依据以及研究内容
1.7.1 立题依据
1.7.2 本论文的主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种与质粒
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 主要实验试剂及来源
2.1.4 主要培养基
2.2 分析方法
2.2.1 菌体浓度测定方法
2.2.2 蛋白浓度测定方法
2.2.3 光谱学性质测定方法(一氧化碳示差法)
2.2.4 P450VpMO酶活力的测定
2.2.5 SDS-PAGE检测分析方法
2.3 实验方法
2.3.1 P450VpMO目的基因与表达载体的克隆及酶连
2.3.2 胶回收方法
2.3.3 大肠杆菌Top10 以及BL21(DE3)感受态细胞制备与质粒转化
2.3.4 菌液PCR验证以及质粒抽提方法
2.3.5 目的蛋白表达与纯化方法
2.3.6 蛋白的浓缩
2.3.7 镍柱的重生
2.3.8 酶学性质的测定
2.3.9 重组P450VpMO底物谱测试
第三章 结果与讨论
3.1 质粒构建与蛋白表达纯化
3.1.1 P450spwi01与P450Vp MO的质粒构建及蛋白表达纯化
3.1.2 P450VpMO质粒构建及蛋白表达纯化
3.2 重组P450VpMO光谱学性质的鉴定
3.3 重组P450VpMO系统进化树的构建
3.4 重组P450VpMO酶学性质测定
3.4.1 p H与温度对重组P450Vp MO酶活力的影响
3.4.2 重组P450VpMO温度稳定性
3.4.3 重组P450VpMO动力学参数测定
3.5 重组P450VpMO的底物谱探索
3.5.1 重组P450VpMO对硫醚类物质的氧化
3.5.2 重组P450VpMO对苯乙烯的催化
3.5.3 重组P450VpMO羟基化作用
3.5.4 重组P450Vp MO O-脱烷基反应
3.5.5 重组P450VpMO对苯胺类物质反应测试
3.5.6 重组P450VpMO对抗生素的降解测试
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录1 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
附录2 :本文中相关反应的液相色谱图
本文编号：3849840
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3849840.html
