金针菇毒素FTX的原核表达体系构建及其对TMV的抗病性机制分析

发布时间：2023-11-25 06:55

　　烟草花叶病毒(TMV)是一种寄主众多、传染性强和抗逆性强的植物病毒,至今尚未有一种方法能对TMV进行根除。绿色环保的生物农药是抑制病毒的方法之一。Flammutoxin(FTX)与其仅相差20个氨基酸的前体物质TEER-decreasing protein(TDP)是仅仅产生于金针菇子实体发育与生长阶段的蛋白质。研究发现,FTX或TDP具有抗TMV特性,但目前还没确认在抗TMV过程中到底是哪种蛋白发挥作用或主要作用。为了确认不同蛋白的抗TMV效果及分析可能的抗病机制,本实验利用大肠杆菌表达体系,成功构建了 FTX和TDP的原核表达重组质粒,随后通过诱导表达获得TDP-pET32a和FTX-pET32a重组蛋白并利用固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。结果显示,采用1mM浓度的诱导剂IPTG,于37℃诱导8h蛋白可以得到较多的蛋白,且pET32a标签蛋白、重组蛋白 FTX-pET32a 和 TDP-pET32a 在 250mM、200mM 和 250mM Elution buffer洗脱下能获得更多的纯化蛋白。以K326普通烟草为研究对象,从蛋白的保护作用和治疗作用两个方面研究了...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词
第1章 前言
    1.1 TMV的危害
    1.2 TMV的防治
        1.2.1 农业防治
        1.2.2 化学防治
        1.2.3 生物防治
    1.3 生物农药抗TMV的机制研究
        1.3.1 对TMV的钝化作用
        1.3.2 对寄主的保护作用
        1.3.3 对寄主的治疗作用
    1.4 FTX和TDP蛋白的研究进展
    1.5 研究内容与意义
        1.5.1 研究内容
        1.5.2 研究意义
第2章 FTX和TDP的原核表达体系的构建
    2.1 试验材料
        2.1.1 主要材料
        2.1.2 pET32a载体图谱
        2.1.3 主要药剂及试剂盒
        2.1.4 主要仪器与设备
        2.1.5 主要试剂和培养基的配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 FTX和TDP基因引物的设计
        2.2.2 金针菇的总RNA提取
        2.2.3 RT-PCR扩增FTX和TDP基因cDNA序列
        2.2.4 重组载体FTX-pET32a和TDP-pET32a的构建
        2.2.5 重组质粒FTX-pET32a和TDP-pET32a转入表达菌株
    2.3 结果与分析
        2.3.1 FTX和TDP蛋白cDNA的RT-PCR结果
        2.3.2 重组质粒菌液PCR鉴定
        2.3.3 FTX和TDP蛋白cDNA序列测定结果
    2.4 本章小结与讨论
第3章 重组蛋白的诱导表达与纯化
    3.1 试验材料
        3.1.1 主要试剂及试剂盒
        3.1.2 主要仪器与设备
        3.1.3 主要试剂的配制
    3.2 试验方法
        3.2.1 各重组蛋白的诱导表达条件优化
        3.2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化
    3.3 结果与分析
        3.3.1 诱导表达最适温度的确定
        3.3.2 SDS-PAGE和Western blot分析蛋白FTX和TDP
        3.3.3 FTX和TDP蛋白的纯化结果
        3.3.4 重组蛋白浓度测定
    3.4 本章小结与讨论
第4章 FTX和TDP对感染TMV烟草的保护作用
    4.1 试验材料、试剂和仪器
        4.1.1 试剂材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 仪器与设备
    4.2 试验方法
        4.2.1 TMV的提纯
        4.2.2 摩擦接种烟草花叶病毒
        4.2.3 各蛋白诱导作用试验处理
        4.2.4 防御酶酶活性的测定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 各试验组烟草症状图
        4.3.2 过氧化物酶活性变化
        4.3.3 多酚氧化酶活性变化
        4.3.4 几丁质酶活性变化
        4.3.5 苯丙氨酸解氨酶活性变化
    4.4 本章小结与讨论
第5章 实时荧光定量PCR检测各蛋白对TMV的治疗作用
    5.1 试验材料
        5.1.1 主要试剂及试剂盒
        5.1.2 主要试剂及试剂盒
        5.1.3 主要仪器与设备
    5.2 试验方法
        5.2.1 各蛋白诱导作用试验处理
        5.2.2 引物设计
        5.2.3 普通RT-PCR扩增检测引物的特异性
        5.2.4 荧光定量PCR(qRT-PCR)分析TMV含量
    5.3 结果与分析
        5.3.1 普通RT-PCR扩增检测引物的特异性
        5.3.2 qRT-PCR动力学溶解曲线
        5.3.3 FTX和TDP处理后烟草中TMV基因表达量的变化
    5.4 本章小结与讨论
第6章 结论与展望
致谢
参考文献



本文编号：3867491