E. coli谷氨酸脱羧酶在B. subtilis中的异源表达、发酵优化及制备γ-氨基丁酸的研究

发布时间：2024-01-22 08:36

　　谷氨酸脱羧酶(GAD)与辅酶磷酸吡哆醛(PLP)结合,专一作用于L-谷氨酸或其钠盐的α-羧基,使其不可逆地脱去一分子CO₂得到γ-氨基丁酸(GABA)。GABA作为重要的抑制性神经递质,是一种价值极高的功能性氨基酸,以食品添加剂的形式广泛应用于食品行业中。酶法制备GABA具有专一高效、不受资源和环境等因素的限制等优点,逐步适用于工业化生产。本课题将来自大肠杆菌(Escherichia coli)的GAD在食品级宿主枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行重组表达。考察了在该重组菌发酵培养基中添加辅酶PLP前体吡哆醛(PL)前后对重组GAD酶活力、温度pH性质的影响。进一步探究了在共表达GAD与磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO)的重组菌发酵培养基中添加价格低廉的辅酶PLP前体吡哆醇(PN)时GAD的产酶情况及其温度pH性质。同时对利用全细胞制备GABA进行了工艺优化。最后在此基础上选择性能较优的菌株进行摇瓶和3-L罐发酵优化,为后续在工业上大量制备食品级GABA打下坚实的基础。主要研究成果有:(1)构建含有E.coli GAD基因的重组菌B.subtili...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 γ-氨基丁酸(GABA)概述
        1.1.1 GABA的结构与功能
        1.1.2 GABA的自然分布及制备工艺
    1.2 谷氨酸脱羧酶(GAD)的介绍
        1.2.1 GAD的理化性质与来源
        1.2.2 GAD在微生物中的作用
    1.3 辅酶磷酸吡哆醛(PLP)生物合成途径
        1.3.1 辅酶PLP前体及PLP的作用
        1.3.2 辅酶PLP合成途径
        1.3.3 PLP补救合成途径关键酶的活性调节
    1.4 枯草芽孢杆菌表达系统概述
        1.4.1 枯草芽孢杆菌分泌机制研究进展
        1.4.2 提高外源蛋白在枯草芽孢杆菌中表达水平的方法
    1.5 立题依据及意义
    1.6 本论文的研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌种与质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要培养基
    2.2 谷氨酸脱羧酶(GAD)重组表达质粒的构建
        2.2.1 目的基因gad B和表达载体p HY300PLK的引物设计和克隆
        2.2.2 目的基因gad B和表达载体p HY300PLK的连接
        2.2.3 感受态E.coli JM109 的热击转化
        2.2.4 质粒的提取与酶切验证
        2.2.5 B.subtilis感受态细胞的制备
        2.2.6 B.subtilis感受态细胞的电击转化
    2.3 谷氨酸脱羧酶(GAD)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO)共表达质粒的构建
        2.3.1 基因组的提取
        2.3.2 引物设计
        2.3.3 表达载体和基因的连接
    2.4 发酵方法
        2.4.1 重组B.subtilis的摇瓶发酵
        2.4.2 重组B.subtilis的3-L罐发酵
    2.5 分析方法
        2.5.1 菌体浓度(OD600)的测定
        2.5.2 细胞干重的测定
        2.5.3 蛋白浓度的测定
        2.5.4 核酸琼脂糖凝胶电泳分析
        2.5.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
        2.5.6 重组谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活测定
        2.5.7 γ-氨基丁酸(GABA)的检测方法
        2.5.8 重组谷氨酸脱羧酶(GAD)的温度pH性质
    2.6 重组GAD全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA)工艺流程
        2.6.1 重组GAD全细胞的获取
        2.6.2 细胞的预处理方式
        2.6.3 全细胞制备GABA流程
第三章 结果与讨论
    3.1 E.coli谷氨酸脱羧酶在B.subtillis中的表达及温度p H性质研究
        3.1.1 重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B的构建
        3.1.2 重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B的摇瓶发酵
        3.1.3 添加辅酶前体吡哆醛(PL)前后的重组GAD温度p H性质比较
    3.2 共表达PNPO对重组E.coli谷氨酸脱羧酶表达及温度p H性质的影响研究
        3.2.1 重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H的构建和重组表达
        3.2.2 重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H的摇瓶发酵
        3.2.3 添加辅酶前体吡哆醇(PN)后的重组GAD温度p H性质研究
    3.3 重组菌全细胞转化制备GABA的工艺优化
        3.3.1 预处理对全细胞制备GABA的影响
        3.3.2 转化温度对全细胞制备GABA的影响
        3.3.3 转化p H对全细胞制备GABA的影响
        3.3.4 加菌量对全细胞制备GABA的影响
        3.3.5 反应时间对全细胞制备GABA的影响
        3.3.6 底物浓度对全细胞制备GABA的影响
    3.4 重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H发酵条件优化
        3.4.1 重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H的摇瓶发酵优化
        3.4.2 吡哆醇(PN)对重组菌B.subtilis/p HY300PLK-gad B-Pdx H3-L罐高密度发酵的影响
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3882547