MXR1磷酸化修饰对AOX1表达的影响

发布时间：2024-02-18 06:04

　　巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)作为目前应用最为广泛的真核微生物表达宿主细胞之一,与其它表达系统相比,P.pastoris表达系统最显著的优势在其具有严格受甲醇诱导的诱导型强启动子-启动醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子(promoter of alcohol oxidase 1,PAOX1),研究发现,该启动子只有在甲醇作为唯一碳源时才发挥功能,当甘油或葡萄糖等碳源存在时,PAOX1受到严重抑制。通过对其诱导机制研究发现,甲醇代谢调控因子1(methanol expression regulator 1,MXR1)是PAOX1发挥启动功能所必须的。目前关于MXR1如何调控PAOX1的机制研究尚不是很清楚,本文通过研究MXR1激活AOX1转录机理,揭示甲醇诱导,甘油阻遏AOX1转录机理。首先通过PULL-DOWN找到与P.pastoris MXR1相互作用的一个蛋白—酪氨酸磷酸酶(Protein phosphotyrosine phosphatase,PTP)。该蛋白在甲醇培养基中与MXR1相互作用,并通过体外实验验证...

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【部分图文】：

图3-1MXR1PULL-DOWN结果及PTP条带Figure3-1MXR1PULL-DOWNresultsandPTPstrips

图3-1MXR1PULL-DOWN结果及PTP条带gure3-1MXR1PULL-DOWNresultsandPTPst115总蛋白；2：在甘油培养基培养的GS115总鉴定与MXR1相互作用的蛋白其中有磷酸酶P能验证苏州金唯智密码子优化然后连....

图3-2PTP异源表达Westernblot验证图

15蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互通过SDS-PAGE电泳，切胶，经过质谱分图3-1MXR1PULL-DOWN结果及PTP条带gure3-1MXR1PULL-DOWNresultsandPTPs115总蛋白；2：在甘油培养基培养的GS115....

图3-3PTP外原表达及功能验证Figure3-3PTPforeignaidexpressionandfunctionverification

第三章结果与讨论记的兔抗二抗1h，PBST洗板5遍，加多功能酶标仪检测结果。酶促反应结束后MXR1磷酸化多肽剩余量酸化抗原多肽，或非磷酸化抗原多肽，孵000)，通过加入纯化的PTP蛋白和只加入，发现加入PTP的样品几乎没有磷酸化抗酸化的蛋白活性，可以将M....

图3-5磷酸酶PTP最适温度Figure3-5OptimumtemperatureofphosphatasePTP

经过BCA法测得蛋白浓度是0.98mg/L，以相同浓度pNPP为底物，相同体积酶在不同的温度反应，10min，1mol/L硫酸钠终止反应，405nm测吸光强度，最适酶促反应温度41℃(图3-5)。图3-5磷酸酶PTP最适温度Figure3-5Optimumtemper....

本文编号：3902032