高效表达海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建与优化
发布时间：2024-07-05 21:28
海藻糖因其独特的生物学特性,具有保护生物大分子生命体特征的功能,被广泛用于食品、药品和化妆品中。目前,被广泛认可的海藻糖制备工艺是单酶法。单酶法是在海藻糖合酶(TreS)的作用下,直接将麦芽糖转化为海藻糖。转化过程相对简单,方便操作,但该方法依然存在不足,一是TreS主要由重组大肠杆菌诱导表达获得;二是胞内表达,获得TreS需高压均质破碎,能耗高,设备投资大,且产品中易残留内毒素。针对上述两点,本论文开展了以下研究工作:(1)选取密度诱导型启动子PsrfA、组成型启动子P43和四个时期特异性启动子PabrB、PspoVG、PLytR、PmmgA为表达元件,四个时期特异性启动子分别在细胞生长对数期、稳定期前期、稳定期和衰亡期表达,将其串联构建得到新的启动子PabrB-spoVG-LytR-mmgA,以pHT01质粒为表达载体,构建了自诱导表达海藻糖合酶的重组枯草芽孢杆菌,并将重组菌分别在摇瓶和发酵罐中发酵验证,得到表达酶活高的重组菌B....
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 海藻糖概述
1.1.1 海藻糖的特征
1.1.2 海藻糖的功能与应用
1.1.3 海藻糖主要的制备方式
1.2 海藻糖合酶概述
1.2.1 海藻糖合酶的特征
1.2.2 海藻糖合酶的作用机理
1.2.3 海藻糖合酶的研究进展
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
1.4 枯草芽孢杆菌调控表达启动子
1.5 枯草芽孢杆菌蛋白分泌
1.6 课题的立题背景和研究内容
1.6.1 立题背景
1.6.2 研究内容
第2章 海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的胞内表达
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要试剂
2.2.2 仪器与设备
2.2.3 主要培养基和溶液
2.2.4 主要菌株、质粒和引物
2.3 实验方法
2.3.1 目的基因片段的获取
2.3.2 重组表达载体的构建
2.3.2.1 pHT01-PsrfA-treS表达载体的构建
2.3.2.2 pHT01-P43-treS表达载体的构建
2.3.2.3 pHT01-PabrBspoVG-LytR-mmgA-treS表达载体的构建
2.3.2.4 基因片段的扩增
2.3.2.5 重叠片段PsrfA-treS与表达质粒pHT01双酶切
2.3.2.6 片段PsrfA-treS与质粒pHT01的连接
2.3.3 枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800n感受态的制备
2.3.4 重组B.subtilis WB800n的构建
2.3.5 重组枯草芽孢杆菌的表达验证
2.3.6 海藻糖合酶的酶活力分析
2.4 结果与讨论
2.4.1 基因的克隆
2.4.1.1 PsrfA和treS基因片段的克隆
2.4.1.2 P43和treS-1基因片段的克隆
2.4.1.3 PabrB-spoVG-LytR-mmgA和treS-1基因片段的克隆
2.4.2 表达质粒的构建
2.4.2.1 质粒pHT01-PsrfA-treS的构建
2.4.2.2 质粒pHT01-P43-treS的构建
2.4.2.3 质粒pHT01-PabrBspoVG-LytR-mmgA-treS的构建
2.4.3 胞内表达重组枯草芽孢杆菌的的构建
2.4.3.1 重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-PsrfA-treS的构建
2.4.3.2 重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的构建
2.4.3.3 重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-PabrBspoVG-LytR-mmgA-treS的构建
2.5 重组菌发酵产酶验证
2.5.1 重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵产酶分析
2.5.2 重组枯草芽孢杆菌在SL发酵罐中发酵产酶比较
2.6 SDS-PAGE蛋白电泳分析
2.7 本章小结
第3章 海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要试剂
3.2.2 主要仪器
3.2.3 主要培养基和溶液
3.2.4 主要菌株、质粒和引物
3.3 实验方法
3.3.1 目的基因片段的克隆
3.3.2 分泌表达载体的构建
3.3.2.1 pHT01-PsrfA-PhoD/YwbN-treS表达载体的构建
3.3.2.2 pHT01-P43-PhoD/YwbN-treS表达载体的构建
3.3.2.3 pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-PhoD/YwbN-treS表达载体的构建
3.3.4 免疫印迹(Western-blot)分析
3.4 结果与讨论
3.4.1 基因的克隆
3.4.1.1 PsrfA、PhoD、YwbN和treS基因片段的扩增
3.4.1.2 P43、PhoD、YwbN和treS基因片段的扩增
3.4.1.3 PabrB-spoVG-LytR-mmgA、PhoD、YwbN和treS两个片段的扩增
3.4.2 表达质粒的构建
3.4.2.1 质粒pHT01-PsrfA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.2.2 质粒pHT01-P43-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.2.3 质粒pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.3 分泌表达重组枯草芽孢杆菌的的构建
3.4.3.1 重组菌B.subtilis/pHT01-PsrfA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.3.2 重组菌B.subtilis/pHT01-P43-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.3.3 重组菌B.subtili/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.5 重组菌发酵产酶验证
3.5.1 分泌型重组枯草芽孢杆菌在5L发酵罐中发酵产酶比较
3.6 免疫印迹(Western-blot)分析
3.7 本章小结
第4章 重组枯草芽孢杆菌的发酵优化
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验菌株
4.2.2 仪器设备
4.2.3 实验药品
4.2.4 主要试剂与培养基配制
4.3 实验方法
4.3.1 菌株活化及酶活力测定
4.3.2 磷酸盐浓度对酶活的影响
4.3.3 碳源对酶活的影响
4.3.4 碳源浓度对酶活的影响
4.3.5 添加金属离子对酶活的影响
4.3.6 不同pH对酶活的影响
4.3.7 发酵后期降低温度对酶活的影响
4.3.8 流加不同浓度蔗糖对酶活的影响
4.4 结果与讨论
4.4.1 磷酸盐浓度对酶活的影响
4.4.2 碳源及碳源浓度对酶活的影响
4.4.3 添加金属离子对酶活的影响
4.4.4 不同pH对酶活的影响
4.4.5 发酵后期降低温度对酶活的影响
4.4.6 流加不同浓度蔗糖对酶活的影响
4.5 本章小结
第5章 总结与展望
5.1 总结
5.2 展望
参考文献
致谢
在学期间主要科研成果
本文编号：4001559
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 海藻糖概述
1.1.1 海藻糖的特征
1.1.2 海藻糖的功能与应用
1.1.3 海藻糖主要的制备方式
1.2 海藻糖合酶概述
1.2.1 海藻糖合酶的特征
1.2.2 海藻糖合酶的作用机理
1.2.3 海藻糖合酶的研究进展
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
1.4 枯草芽孢杆菌调控表达启动子
1.5 枯草芽孢杆菌蛋白分泌
1.6 课题的立题背景和研究内容
1.6.1 立题背景
1.6.2 研究内容
第2章 海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的胞内表达
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 主要试剂
2.2.2 仪器与设备
2.2.3 主要培养基和溶液
2.2.4 主要菌株、质粒和引物
2.3 实验方法
2.3.1 目的基因片段的获取
2.3.2 重组表达载体的构建
2.3.2.1 pHT01-PsrfA-treS表达载体的构建
2.3.2.2 pHT01-P43-treS表达载体的构建
2.3.2.3 pHT01-PabrBspoVG-LytR-mmgA-treS表达载体的构建
2.3.2.4 基因片段的扩增
2.3.2.5 重叠片段PsrfA-treS与表达质粒pHT01双酶切
2.3.2.6 片段PsrfA-treS与质粒pHT01的连接
2.3.3 枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800n感受态的制备
2.3.4 重组B.subtilis WB800n的构建
2.3.5 重组枯草芽孢杆菌的表达验证
2.3.6 海藻糖合酶的酶活力分析
2.4 结果与讨论
2.4.1 基因的克隆
2.4.1.1 PsrfA和treS基因片段的克隆
2.4.1.2 P43和treS-1基因片段的克隆
2.4.1.3 PabrB-spoVG-LytR-mmgA和treS-1基因片段的克隆
2.4.2 表达质粒的构建
2.4.2.1 质粒pHT01-PsrfA-treS的构建
2.4.2.2 质粒pHT01-P43-treS的构建
2.4.2.3 质粒pHT01-PabrBspoVG-LytR-mmgA-treS的构建
2.4.3 胞内表达重组枯草芽孢杆菌的的构建
2.4.3.1 重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-PsrfA-treS的构建
2.4.3.2 重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的构建
2.4.3.3 重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-PabrBspoVG-LytR-mmgA-treS的构建
2.5 重组菌发酵产酶验证
2.5.1 重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵产酶分析
2.5.2 重组枯草芽孢杆菌在SL发酵罐中发酵产酶比较
2.6 SDS-PAGE蛋白电泳分析
2.7 本章小结
第3章 海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 主要试剂
3.2.2 主要仪器
3.2.3 主要培养基和溶液
3.2.4 主要菌株、质粒和引物
3.3 实验方法
3.3.1 目的基因片段的克隆
3.3.2 分泌表达载体的构建
3.3.2.1 pHT01-PsrfA-PhoD/YwbN-treS表达载体的构建
3.3.2.2 pHT01-P43-PhoD/YwbN-treS表达载体的构建
3.3.2.3 pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-PhoD/YwbN-treS表达载体的构建
3.3.4 免疫印迹(Western-blot)分析
3.4 结果与讨论
3.4.1 基因的克隆
3.4.1.1 PsrfA、PhoD、YwbN和treS基因片段的扩增
3.4.1.2 P43、PhoD、YwbN和treS基因片段的扩增
3.4.1.3 PabrB-spoVG-LytR-mmgA、PhoD、YwbN和treS两个片段的扩增
3.4.2 表达质粒的构建
3.4.2.1 质粒pHT01-PsrfA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.2.2 质粒pHT01-P43-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.2.3 质粒pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.3 分泌表达重组枯草芽孢杆菌的的构建
3.4.3.1 重组菌B.subtilis/pHT01-PsrfA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.3.2 重组菌B.subtilis/pHT01-P43-PhoD/YwbN-treS的构建
3.4.3.3 重组菌B.subtili/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-PhoD/YwbN-treS的构建
3.5 重组菌发酵产酶验证
3.5.1 分泌型重组枯草芽孢杆菌在5L发酵罐中发酵产酶比较
3.6 免疫印迹(Western-blot)分析
3.7 本章小结
第4章 重组枯草芽孢杆菌的发酵优化
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验菌株
4.2.2 仪器设备
4.2.3 实验药品
4.2.4 主要试剂与培养基配制
4.3 实验方法
4.3.1 菌株活化及酶活力测定
4.3.2 磷酸盐浓度对酶活的影响
4.3.3 碳源对酶活的影响
4.3.4 碳源浓度对酶活的影响
4.3.5 添加金属离子对酶活的影响
4.3.6 不同pH对酶活的影响
4.3.7 发酵后期降低温度对酶活的影响
4.3.8 流加不同浓度蔗糖对酶活的影响
4.4 结果与讨论
4.4.1 磷酸盐浓度对酶活的影响
4.4.2 碳源及碳源浓度对酶活的影响
4.4.3 添加金属离子对酶活的影响
4.4.4 不同pH对酶活的影响
4.4.5 发酵后期降低温度对酶活的影响
4.4.6 流加不同浓度蔗糖对酶活的影响
4.5 本章小结
第5章 总结与展望
5.1 总结
5.2 展望
参考文献
致谢
在学期间主要科研成果
本文编号：4001559
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/4001559.html
