团头鲂肠道菌株MA35产纤维素酶分离纯化及性质分析

发布时间：2020-04-02 17:12

【摘要】：纤维素酶是一类催化纤维素链β-1,4-糖苷键水解,是将纤维素转化为葡萄糖、纤维二糖、纤维低聚糖的酶,传统上将其分为三类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,纤维素酶可被广泛应用于食品、饲料、纺织、发酵等领域。纤维素酶来源十分广泛,昆虫、动物体、细菌、真菌等都能产生纤维素酶,且纤维素酶多来源于微生物,尤其是细菌与真菌。本课题以团头鲂肠道菌株雪白曲霉MA35(Aspergillus niveus MA35)为出发菌株,通过发酵的方式生产纤维素酶进行分离纯化,从中得到了一种内切型纤维素酶,并且研究该酶的酶学性质,不仅对草食性鱼类饲料配比的研究提供了一定的技术支持,也为构建真菌纤维素酶工程菌种提供了优良的基因源。本文采用硫酸铵分级沉淀,Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶层析等手段,从Aspergillus niveus MA35发酵菌体内制备出了电泳纯的纤维素酶制剂,比活力由5.97 U/mL提高到36.6 U/mL,纯化倍数为6.13,回收率为34%,根据SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳推算可知,该酶分子量约为45 kD。酶学性质研究表明,该内切型纤维素酶水解底物羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的最适温度和最适pH分别为45℃和4.5,米氏常数Km为5.92 mg/mL,最大反应速度Vmax为1.72×10~(-1) mg/(mL·min)。酶稳定性研究表明在温度30~55℃以及pH4.0~8.0之间具有良好的稳定性。研究各离子对酶活的影响,其中Cl~-,I~-,Br~-,Na~+,Li~+,K~+对酶活力没有明显影响;Zn~(2+),Mn~(2+)对酶活力有明显地激活作用;Ca~(2+)在低浓度下对酶有轻微地激活作用,在高浓度下对酶没有明显地影响;重金属离子Cu~(2+),Pb~(2+),Fe~(2+)对酶有强烈地抑制作用,对其抑制类型的研究表明这三种金属离子对该酶的抑制为不可逆抑制。有机试剂对酶活力影响的研究表明,有机试剂乙醇、乙二醇、丙酮和苯酚对纤维素酶有强烈的抑制作用,其半抑制浓度分别为18.3%、8.3%、0.8%、0.5%,由此可判断其中苯酚对酶的抑制作用最强,乙醇较轻微地对酶活有抑制作用,符合工业生产中利用醇沉法对蛋白质(酶)进行浓缩的普遍规律。再进一步研究化学修饰剂(溴乙酸、二硫苏糖醇、乙酸酐、苯甲基磺酰氟、对氯汞苯甲酸、过氧化氢、乙酰丙酮)对该酶的修饰作用,研究该酶活性中心的必需基团,结果表明组氨酸咪唑基与赖氨酸的ε-氨基是该酶活性中心的必需基团,巯基、精氨酸残基、丝氨酸残基和甲硫氨酸残基不是该酶活性中心必需基团,二硫键与该酶活力无关。溴乙酸对纤维素酶的抑制作用为可逆混合型抑制,乙酸酐对该酶的抑制作用为不可逆非竞争性抑制。
【图文】：

纤维素,分子式

上海海洋大学硕士学位论文第一章绪论纤维素维素是一种由 D-葡萄糖苷以 β-1,4 糖苷键连接而成的线型同质多聚物C6H10O5)n，聚合度约在 100-15000 个葡萄糖残基[13, 14]，是世界上最丰物资源。其化学结构通常有两种表示方式，分别为 Haworth 结构式和构式（图 1-1）。自然界中的纤维素主要存在于植物的细胞壁中，并且细菌以及被囊动物中也存在纤维素[14-18]。

示意图,纤维素酶,纤维糊精

酶酶的概念及分类可以催化纤维素链中 β-1,4-糖苷键水解，将纤维素转化葡萄糖，根据不同机理分类有略微的差异，其中经典分类是基域和底物特异性，将纤维素酶分为三种类型: β-1,4-内切葡葡糖苷酶{非还原端纤维素水解酶(EC 3.2.1.91)、还原性末.2.1.176)、纤维素糊精酶(EC 3.2.1.74)}，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2先将纤维素水解为纤维二糖、纤维糊精以及其他纤维寡糖随机水解纤维素链上的 β-1,4-糖苷键，，释放出不同长度的寡二糖）。外切葡萄糖苷酶作用于纤维素的还原和非还原性末以及其他短寡糖，纤维糊精酶作用于可溶性物质纤维寡糖后 β-葡萄糖苷酶进行水解纤维糊精和纤维二糖转化成葡萄作用于纤维素的示意图如图 1-2[27]所示。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.1

【参考文献】