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糖基对蛋白酶法与超高压消减鸡卵类黏蛋白变应原性的影响

发布时间:2020-04-07 22:17
【摘要】:鸡卵类黏蛋白(hen-egg ovomucoid,HOVM)是目前已知四种鸡蛋卵清过敏原蛋白中致敏性最强的。该蛋白富含糖基,使其拥有较高的结构稳定性、耐热性、抗蛋白酶水解特性等,但糖基对其过敏原的影响研究较少。本研究采用苯酚-硫酸法确定糖苷酶酶解蛋白总糖含量,茚三酮法定量蛋白水解度,圆二色性光谱法表征蛋白质二级结构,荧光光谱法分析蛋白质表面疏水性变化,间接酶联免疫吸附法通过分析过敏原蛋白与IgG结合能力来表征其变应原性的变化。首先探究了热处理对于HOVM的结构以及其与IgG结合能力的影响;然后利用四种特异性糖苷酶(β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄胺糖苷酶和肽-N-糖苷酶F)对HOVM的糖基进行不同程度的消减得到脱糖基蛋白(deglycosylated hen-egg ovomucoid,dHOVM),并进一步探究糖基对于蛋白酶法以及超高压法处理HOVM变应原性的影响,从而分析糖基对其结构(包括二级结构和表面疏水性)与变应原性的影响,研究结果如下。首先,热处理会影响HOVM的表面疏水性指数以及其与IgG结合能力:随着热处理强度(温度和时间)的增加,HOVM与IgG的结合能力会下降,特别是90℃和100℃处理下,HOVM与IgG的结合能力显著下降并在加热110 min时达到最低值;同时,随着热处理强度的提高,表面疏水性指数会先显示出上升的趋势,然后再下降的趋势。其次,糖基含量影响超高压作用下的HOVM结构,从而影响其与IgG的结合能力。随着糖基含量的减少,100~400 MPa范围内dHOVM二级结构中β-折叠的含量降低,同时表面疏水性指数S_0及其与IgG的结合能力呈同趋势改变,说明此时HOVM的三级结构变化影响了与IgG的结合能力;500~800 MPa时,糖基含量对二级结构的改变影响不大,其表面疏水性指数S_0及其与IgG的结合能力无一致性的变化规律,说明此时随着压力的增强,HOVM的变应原性改变已不再与三级结构直接相关。并且,糖基含量会影响蛋白酶酶解HOVM的水解度,进而影响其与IgG的结合能力。将糖苷酶消减作用后的dHOVM分别与三种蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶)进行酶解:随着糖基含量的降低,对dHOVM的水解度会逐渐升高,且不同蛋白酶对dHOVM的水解作用强度从小到大依次为胰蛋白酶(水解度3.78%~5.09%)、木瓜蛋白酶(水解度6.63%~19.40%)和菠萝蛋白酶(水解度7.36%~24.91%);反应后的产物与IgG的结合能力发生改变:其中经胰蛋白酶酶解后的HOVM与IgG结合能力降幅为1.8%~29.61%,木瓜蛋白酶酶解后其与IgG结合的能力降幅为37.35%~46.73%,菠萝蛋白酶酶解后其与IgG结合的能力降幅为41.89%~47.06%;经β-半乳糖苷酶脱糖基作用后(此时HOVM上糖基含量为15.21%)再经菠萝蛋白酶水解的产物与IgG结合能力最弱。
【图文】:

序列,氨基酸残基,序列,糖基化位点


图 1-1 HOVM 的氨基酸残基序列Fig. 1-1 Amino acid residual sequence of HOVM个肽序列残基(-24~-1),圆圈表示成熟的蛋白质序列。粗黑色线条(连接半键。波浪线表示完全糖基化位点,灰色虚线表示部分糖基化位点。

黏蛋白,糖基,结构示意图,变应原性


10图 1-2 鸡卵类黏蛋白中糖基结构示意图[90]Fig. 1-2 Structural diagram of HOVM sugar group 1-2 可知,图(a)为 HOVM 三种糖基形式的共有结构,据研究其约占整个糖蛋白分子的 14 %;和图(c)为糖基(a)衍生的产物。究目的及意义课题采用四种专一性糖苷酶(β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-N-乙酰苷酶和肽-N-糖苷酶 F)作用鸡卵类黏蛋白(HOVM)糖基,通过比较 量与 HOVM 水解度推断糖基在蛋白中起到的作用;对比脱糖基蛋白经二级结构组成含量、其表面疏水性和变应原性的变化。分析糖基对其变,从而找到糖基对蛋白酶法与超高压消减 HOVM 结构与变应原性的关对 HOVM 蛋白结构与变应原性的影响。为后续研究其致敏性的消减提。
【学位授予单位】:天津商业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TS201.21

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本文编号:2618455

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