鹰嘴豆纳豆发酵工艺优化及纳豆激酶的分离纯化研究

发布时间：2020-04-27 18:09

【摘要】：纳豆是将纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种到煮熟的大豆中,在一定条件下发酵而成的传统豆类发酵食品。具有溶血栓、抗氧化、抗肿瘤、预防骨质疏松等多种保健功能。纳豆中的纳豆激酶具有良好的溶栓功能,已成为目前的研究热点。本课题选取四种豆类作为发酵原料,对鹰嘴豆纳豆固体发酵工艺进行了优化,同时对纳豆激酶提取纯化工艺进行了研究,并通过加速储存实验对鲜纳豆及纳豆激酶冻干粉的储存稳定性及储存期进行了探索。主要研究内容及结果如下:(1)以纳豆激酶和纳豆感官评价为指标,通过单因素实验及响应面实验研究豆类种类、蒸煮时间、基质含水量、接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间对纳豆发酵的影响。结果表明,鹰嘴豆发酵纳豆中纳豆激酶含量最高,达986.3 IU/g,比同水平下黄豆发酵纳豆中的纳豆激酶活性高。鹰嘴豆发酵纳豆最佳工艺条件为:接种量6%,发酵温度为34℃,发酵时间为47h,所建立模型预测纳豆激酶活性为978.2 IU/g,实验所得纳豆激酶活性为986.3 IU/g,与理论预测值接近。所建立模型能够预测鹰嘴豆发酵纳豆过程。(2)纳豆激酶的分离纯化工艺优化。采用离心、盐析、葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱层析对纳豆激酶进行提取纯化,分别对盐析及柱层析进行了工艺优化。盐析法提取纳豆激酶的最优工艺为:v_(硫酸铵):v_(粗酶液)=2:1,盐析搅拌转速为600 r/min,盐析温度40℃,提取时间16 h时,此工艺下所提取纳豆激酶酶活性为350.2 IU/mL。葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱层析纯化纳豆激酶最优工艺为:纳豆激酶上样量1 mL,上样浓度为0.1 g/mL,洗脱剂用量150 mL,洗脱时间500 min,所纯化纳豆激酶酶活达到89032.6 IU/mL,纯度高达90%。(3)利用加速储存实验对鲜纳豆及纳豆激酶冻干粉的储存稳定性进行了研究。通过加速储存实验估算出鲜纳豆分别在25℃、4℃储存时,酶活损失10%的时间分别为16.6 d和1.28年;酶活损失50%的时间分别为0.26年和7.62年。纳豆激酶冻干粉分别在25℃、4℃储存时,酶活损失10%的时间分别为14.6 d和0.47年;酶活损失50%的时间分别为0.26年和3.11年。通过本课题的研究,筛选了一种适合纳豆发酵的豆类——鹰嘴豆,明确了鹰嘴豆发酵纳豆最优工艺,并对纳豆激酶的提取纯化进行了工艺优化,同时利用加速储存实验明确了鲜纳豆及纳豆激酶冻干粉的储存稳定性及储存期。课题的完成为纳豆及纳豆激酶的规模化生产提供了相关理论基础。
【图文】：

示意图,血管内凝血,纳豆激酶,溶栓

图 1-1 纳豆激酶溶栓机理Figure 1-1 Nattokinase thrombolytic mechanism小板与纤维蛋白在血管内凝血形成的，而凝血反应常运作时，血液的动态平衡是由各个系统相互制约现问题，就会打破这种平衡，导致血栓的形成。据激酶具有促进纤维蛋白溶解的能力，从而具有溶血豆激酶的溶栓机理示意图。由图可知，纳豆激酶的溶酶原激活剂（tissue PlamnipenActivator, t-PA）来实生内源t-PA的同时，降解纤溶酶激活剂的抑制剂（P，减少其对 t-PA 的抑制作用。t-PA 可激活体内纤溶外，纳豆激酶激活尿激酶原使其形成尿激酶，激活对纤溶蛋白原不敏感，但能直接将纤维蛋白降解为激酶正是由于这种直接和间接相互结合的溶栓机理力的检测方法

生长曲线,纳豆芽孢杆菌,生长曲线,纳豆

6、48、72、96h，转入 4 ℃冰箱后熟 24h，以发酵所得成熟纳豆中纳评价结果为指标，研究发酵时间对纳豆发酵的影响。熟时间对纳豆发酵的影响0g鹰嘴豆加入至250mL锥形瓶中清洗浸泡，加水至25%的基质含水量下高压蒸煮 20 min，按 3%接种量接入纳豆芽孢杆菌种子液，33 ℃静 4 ℃冰箱分别后熟 16、20、24、28、32h，以所发酵成熟纳豆中纳豆价结果为指标，，研究后熟时间对纳豆发酵的影响。应面优化因素实验的基础上进行响应面优化实验，选取影响较大的三个因素接酵温度（因素 B）、发酵时间（因素 C），以纳豆激酶活性为指标，采0.6 软件进行 3 因素 3 水平实验设计，对实验结果进行分析讨论，得出结果与分析豆杆菌生长曲线
【学位授予单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS214

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