热加工鲜花生的蛋白致敏性变化评估研究

发布时间：2020-06-10 23:22

【摘要】：花生作为八大类食物过敏原之一,是一种常见的食物和食品加工原料,可引起严重的过敏反应。花生经常是经过加工之后被食用,但是加工对花生蛋白致敏性的影响至今还没有统一的认识,这可能与现有研究中不统一的蛋白提取方法和致敏性评估方法有关。探索鲜花生加工后,蛋白提取方法和致敏性评估方法对花生蛋白潜在致敏性的影响,揭示热加工对鲜花生蛋白的消化性和潜在致敏性的影响,将为花生制品加工的优化提供依据。本论文以新鲜花生为研究对象,采用不同的热加工方式进行处理,并用丙酮脱脂制备成脱脂粉。一方面利用不同方法提取脱脂粉中的花生蛋白,比较不同提取方法和加工方法对花生蛋白提取的影响;另一方面利用花生脱脂粉进行体外模拟胃肠消化,分析热加工处理对蛋白的消化性的影响。最后通过不同的体外致敏性评估方法,分析加工前后花生的蛋白提取液和脱脂粉消化产物的IgE结合能力以及诱导人嗜碱性粒细胞KU812脱颗粒的能力。研究的主要方法、结果和结论如下:1.将新鲜花生进行相应的处理:鲜花生带壳水煮(100℃,15 min)、鲜花生去壳水煮(100℃,15 min)、鲜花生带壳烘烤(170°C,35 min)、鲜花生去壳烘烤(170°C,20 min)和鲜花生去壳油炸(152°C,400 s),之后去壳去红衣,研磨,丙酮脱脂,得到花生脱脂粉。采用凯氏定氮法测定各样品中的总蛋白含量。结果表明,花生样品的总蛋白含量为51.84%,经过热加工后样品中总蛋白含量为52.29%(带壳水煮)、51.69%(去壳水煮)、51.78%(带壳烘烤)、52.71%(去壳烘烤)和54.21%(油炸),即热加工后花生总蛋白含量无显著变化。2.利用三种提取方法从脱脂粉中提取花生蛋白:方法一用50 mmol/L的Tris-HCl(pH 7.2)与脱脂粉10:1的体积质量比重复浸提;方法二用20 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.2)与脱脂粉20:1的体积质量比混合浸提取;方法三用高序列离液剂与脱脂粉以50:1的体积质量比混合,超声提取。利用考马斯亮蓝法测定所得提取液中的蛋白浓度并计算提取率,通过电泳分析各提取液中的蛋白组分差异。结果表明,方法一和方法二对热加工后花生中蛋白的提取率分别处于7.20%~18.58%和5.21%~23.24%范围内,显著低于各自对未加工花生的蛋白提取率(45.35%,40.77%)。从电泳结果可以看出方法三提取得到的花生蛋白所含的蛋白组分条带最多;分析各过敏原组分含量可知,在Tris-HCl缓冲液(方法一和方法二)提取的提取液中,热加工明显降低了Ara h 1单体的提取率,方法一对未加工花生样品中的Ara h 1单体的提取率为29.55%,而热加工后的提取率最高仅有1.57%(去壳烘烤)。在方法三得到的提取液结果中可以看到,烘烤虽降低了Ara h 1和Ara h 2等蛋白单体的提取效率,但提取获得了较多的高分子量蛋白聚集体。3.利用圆二色光谱法和紫外光谱法测定花生蛋白提取液的高级结构,利用Tricine-SDS-PAGE鉴定脱脂粉中花生总蛋白的消化性。结果表明,不同提取方法得到的花生蛋白的高级结构不同。方法一提取得到的带壳烘烤、去壳烘烤和油炸花生蛋白的α-螺旋含量(分别为24.05%,15.70%,11.80%)比方法二中对应样品的α-螺旋含量高(分别为3.05%,8.75%,5.45%)。在方法三的提取过程中,花生蛋白的结构会被破坏,对鲜花生未加工样品而言,方法一和方法二所提取得到的花生蛋白中α-螺旋含量在20%左右(分别为23.10%和20.05%),而方法三提取得到的未加工花生蛋白中α-螺旋含量仅有7.10%。热加工也会影响花生蛋白的高级结构,表现为α-螺旋或β-结构含量的降低,使得花生蛋白结构展开或无序。4.利用竞争抑制ELISA法鉴定花生蛋白提取液和花生脱脂粉胃肠消化产物的IgE结合能力,并利用BLI方法测定过敏原与IgE的结合常数。结果显示,BLI方法的实验结果与ELISA检测结果高度一致。在Tris-HCl(方法一和方法二)提取的情况下,带壳水煮处理和带壳烘烤处理可以显著降低花生蛋白的IgE结合能力,去壳烘烤处理不会显著影响花生蛋白的IgE结合能力,油炸增强了花生蛋白的IgE结合能力。方法一中各样品的IC_(50)值为:未加工1.22μg/mL、带壳水煮3.29μg/mL、去壳水煮1.81μg/mL、带壳烘烤2.78μg/mL、去壳烘烤0.95μg/mL和油炸0.73μg/mL,方法二中各样品的IC_(50)值为:未加工1.14μg/mL、带壳水煮3.77μg/mL、去壳水煮2.74μg/mL、带壳烘烤4.93μg/mL、去壳烘烤1.25μg/mL和油炸0.67μg/mL。在方法三提取得到的花生蛋白中(鲜花生未加工样品IC_(50)=11.02μg/mL),带壳水煮(IC_(50)=13.12μg/mL)和去壳水煮(IC_(50)=10.76μg/mL)均不会显著影响花生蛋白的IgE结合能力,而烘烤(带壳烘烤和去壳烘烤)和油炸(IC_(50)分别为7.84μg/mL,6.64μg/mL,3.29μg/mL)处理可以显著提高花生蛋白的IgE结合能力。这说明不同的提取方法,会影响花生蛋白的IgE结合能力的检测结果。对脱脂粉进行体外模拟消化后,不同热加工花生的脱脂粉消化产物的IgE结合能力均低于未加工花生,经过胃消化后,不同处理样品的IC_(50)值分别为:未加工3.13μg/mL,带壳水煮5.67μg/mL,去壳水煮4.70μg/mL,带壳烘烤20.42μg/mL,去壳烘烤6.33μg/mL,油炸5.93μg/mL;经过肠消化后,不同处理样品的IC_(50)值分别为:未加工0.48μg/mL,带壳水煮3.92μg/mL,去壳水煮5.05μg/mL,带壳烘烤22.90μg/mL,去壳烘烤3.43μg/mL,油炸3.98μg/mL。5.利用KU812细胞模型,通过测定过敏原刺激后,检测胞内钙离子水平、上清液β-氨基己糖苷酶、组胺和IL-4等细胞因子的释放量,评价蛋白提取液和脱脂粉消化产物诱导嗜碱性粒细胞脱颗粒能力。结果表明,在Tris-HCl缓冲液进行蛋白提取时(方法一和方法二),较统一的结果是烘烤处理(带壳烘烤和去壳烘烤)可以引起较高的细胞脱颗粒程度,方法一提取的花生蛋白刺激细胞后,细胞内的钙离子水平分别为:未加工65.17%,带壳烘烤80.26%,去壳烘烤74.41%,上清液中组胺释放量分别为:未加工7.90ng/mL,带壳烘烤9.94ng/mL,去壳烘烤11.11 ng/mL;方法二提取得到的花生蛋白刺激细胞后,细胞内的钙离子水平分别为:未加工68.66%,带壳烘烤73.23%,去壳烘烤组为70.79%,上清液中组胺释放量分别为:未加工8.12 ng/mL,带壳烘烤10.05ng/mL,去壳烘烤组为9.56 ng/mL;而在方法三提取得到的花生蛋白提取液中,各样品的花生蛋白刺激细胞后产生的各细胞因子的水平变化不一;经胃肠消化后,水煮处理(带壳水煮和去壳水煮)的花生刺激细胞可引起四种细胞因子不同程度的降低,即细胞脱颗粒程度降低,去壳烘烤花生蛋白可引起细胞因子释放水平和胞内钙离子水平的升高,增强了细胞脱颗粒程度,带壳烘烤和油炸处理则不会显著地影响花生的潜在致敏性。
【图文】：

花生,可溶性蛋白,脱脂粉,方法

图 2.1 花生总蛋白以及不同提取方法得到的可溶性蛋白的含量PPE 1：方法一提取得到的花生蛋白提取液；PPE 2：方法二提取得到的花生蛋白提取液；PPE 3：方法三提取得到的花生蛋白提取液；DPP：花生脱脂粉。Figure 2.1 The total protein and soluble protein of peanut extracted by different methodsPPE 1: The protein extracts extracted by method 1, PPE 2: The protein extracts extracted bymethod 2, PPE 3: The protein extracts extracted by method 3, DPP: Defatted peanut powder.花生经过热加工后，研磨，脱脂制备成脱脂粉并衡重，通过凯氏定氮法检测热加工前后各花生样品中的总蛋白含量，由图 2.1 可知，带壳水煮、油炸和去壳烘烤处理后花生总蛋白含量略高于鲜花生未加工组，但均不具有显著性差异，故，热加工处理并不会影响花生中总蛋白含量，且花生脱脂粉中总蛋白含量在51.69%~54.22%之间。利用三种不同的蛋白提取方法进行花生脱脂粉中可溶性蛋白的浸提。方法一可以从鲜花生未加工样品中提取约 45.35%的蛋白，，但是加工处理后，可提取的蛋白量显著降低，从水煮鲜花生样品中分别提取得到 18.58%和 15.68%的蛋白，

电泳图,提取方法,电泳图,热加工

第 2 章热加工鲜花生的蛋白提取以及数量分析3、38、36 kDa）处缺失一个条带，且无低分子量的弥散一可以提取得到所有需要的过敏原条带，但可能由于提降解，此外，方法一和方法二不适合提取热加工花生中物，方法二和方法三都可能导致 Arah3/4 条带的丢失，干扰提取得到更多的 Ara h 1 和高分子量聚集物，高分加工引起蛋白结构的变化具有很重要的价值，可以反映敏原蛋白的整体变化。另外，研究还发现经过烘烤和油聚集。A
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.21

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