乳及乳制品中牛羊源性成分的PCR高分辨熔解检测方法研究

发布时间：2020-07-30 01:26

【摘要】：乳及乳制品掺假鉴别是食品安全质量控制面临的重要挑战。近年来PCR尤其是多重PCR为乳制品动物源性的快速鉴定提供了重要方法,但是大多利用电泳、多色荧光标记或者测序实现多重检测,操作繁琐成本较高。本研究主要利用HRM技术建立多重PCR检测方法,对乳及乳制品市场上常见的山羊、绵羊、牛和水牛四种动物源性成分,实现准确、快速、低成本的鉴别检测。具体研究和结果如下:(1)水牛乳中牛乳成分鉴别的双重PCR-HRM检测方法研究。通过比对牛和水牛的线粒体基因组序列,分别设计了牛和水牛的物种特异性引物。实验结果显示,PCR扩增产物的Tm值分别为77℃和81℃,在传统熔解曲线中存在交叉重叠,同时检测牛和水牛线粒体DNA时会有干扰存在;而在HRM分析中,牛和水牛的扩增产物的熔解峰则完全分离,表明HRM相对于传统熔解曲线,更容易实现对Tm差异较小扩增产物的准确有效区分。进一步优化了双重PCR-HRM反应体系,实现了对水牛乳掺伪的牛乳成分的有效鉴定,对水牛乳中掺假的牛乳成分最低检出限为1%,并且通过对熔解峰高和掺假比例的对数值进行线性拟合,能够实现对掺假比例的相对定量。(2)基于特异性引物的乳制品中山羊、绵羊、牛和水牛乳成分的多重PCR-HRM检测方法研究。为了进一步提高检测通量,在前面工作的基础上,通过引物的筛选和调节,建立了一种可以同时检测四种乳品动物源性成分的方法。结果显示,四重PCR-HRM体系中山羊、绵羊、牛和水牛扩增产物的熔解温度分别为86.7℃、77.7℃、83.7℃和80.2℃,熔解峰之间没有重叠。特异性、灵敏度以及不同组合样品的实验结果表明,该方法具有良好的特异性和灵敏度,各物种之间没有相互干扰。该方法对绵羊线粒体DNA模板的检出限为2pg,对山羊、牛和水牛线粒体DNA检出限则为0.2pg,并可实现乳及乳制品市售样品中牛羊源性成分的快速准确鉴别检测。(3)山羊乳中牛乳成分鉴别的双重PCR-HRM方法研究。在上述工作中,PCR-HRM能够有效区分Tm差异较小的扩增产物,但是Tm差异仍需2℃。在本章工作中,利用HRM技术能够提供的更丰富的熔解曲线信息,实现了对Tm差异1℃的山羊和牛PCR扩增产物的同时检测。结果显示,山羊和牛的扩增产物Tm分别为80℃和80.3℃,HRM熔解峰相互重叠难以同时鉴别牛羊源性组分,但是通过HRM熔解曲线形状分析可以实现羊乳和牛乳成分的同时鉴别。此外,该方法还可以定量检测混合样品的掺假比例,牛乳对羊乳的掺假检出限到达0.1%。因此,PCR-HRM能够对Tm差异1℃的多重扩增产物实现准确的鉴别检测。(4)基于通用引物的乳制品中山羊、绵羊、牛和水牛源性成分的PCR-HRM检测方法研究。以上多重PCR反应中,需要使用多对特异性引物实现对多个物种的同时鉴别,多对引物的存在容易引起非特异性扩增,并且引物间扩增效率不一致、需要多次反复优化。为了克服这种局限,通过设计一对通用引物,实现了在同一PCR反应中能够同时扩增山羊、绵羊、牛和水牛的目的基因。结果显示,该引物对的通用性和特异性良好,且各扩增序列都会产生具有自己独特特征的HRM熔解曲线,根据这种差异能够实现这4种乳源性成分的快速鉴别。此外,该方法能够对所有15种可能的组合,实现准确有效的区分,并能够定量牛乳与水牛乳以及牛乳与山羊乳的掺假比例。因此,PCR-HRM技术可以实现乳及乳制品中牛羊源性成分的低成本快速鉴别。
【学位授予单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.7
【图文】：

熔解曲线,高分辨,染料,技术

图 1-2 高分辨熔解技术中的染料对比Fig. 1-2 HRM saturating and non-saturating dyes（1）影响 HRM 分析的 PCR 试剂与扩增条件、荧光染料及仪器软件与普通 PCR 反应一样，选择可靠的 PCR 反应试剂以及合适的扩增反应条件，以确获得高纯度的 PCR 特异性产物对于 HRM 分析的成功也至关重要。PCR 反应试剂如NA 聚合酶、PCR 缓冲液，扩增条件包括退火温度、循环次数等条件均直接影响 PCR物的质量，其中引物二聚体和非特异性扩增产物的生成将降低样品的扩增效率，影响CR 产物的熔解和 HRM 分析的准确性。此外，缓冲溶液的离子强度及添加剂也影响着CR 结束后的熔解步骤和 HRM 分析的分辨率。因此，PCR 试剂与扩增条件都需要仔细化，必要时需在进行 HRM 分析之前，使用经典的熔解曲线分析或者凝胶电泳对 PCR物的特异性进行检验，以确认 HRM 熔解曲线中的差异源于模板 DNA 中的序列变异。饱和荧光染料是经典熔解曲线分析和 HRM 分析之间最大的区别。SYBR Green I 染用于经典熔解曲线分析，但由于其对 PCR 的抑制作用较强，属于非饱和染料，加之染本身在 DNA 双链熔解的过程中容易发生重排，导致熔解结果失真并影响检测的分辨

乳中,总DNA,凝胶电泳

乳制品中牛羊源性成分的 PCR 高分辨熔解检测方法与验证整性鉴定提取出高质量的 DNA 是运用 PCR 技术进选择的方法合适，其可以最大限度地提高在。依据实验室已有的工作基础，这里选用A[38]。对提取的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，明磁珠法提取的 DNA 完整性良好，没有到理想的扩增区域，相对于山羊、奶牛和可能是由于绵羊 DNA 的质量浓度较小，需

熔解曲线,水牛,奶牛,实时荧光PCR

牛乳中掺假奶牛乳的双重 PCR 研究，主要是根据作繁琐、耗时，探针法针对不同的靶标设计特异双重 PCR-HRM 克服了以上的不足，实现了快速通过设计的特异性引物对奶牛和水牛 DNA 进行牛和水牛在 35 个循环内可以产生明显的扩增曲的片段大小分别 161bp 和 175bp，通过琼脂糖凝2-2 插图），在水牛和奶牛模板等比例混合样品中的扩增片段长度相差较小（14bp），采用琼脂糖凝。传统的熔解曲线水牛和奶牛的熔解温度分别为重叠部分（图 2-3A），根据曾少灵等[59]的研究，双重 PCR 反应时，混合模板的熔解曲线会积累显此，为了同时鉴别奶牛和水牛乳源性成分，采用鉴别，结果显示（图 2-3B）水牛和奶牛特异性引熔解曲线可以有效区分水牛和奶牛成分，这就水牛乳中掺假的奶牛乳成分提供了理论依据。

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