拟穴青蟹磷酸丙糖异构酶的晶体结构与表位突变研究

发布时间：2021-11-13 21:54

　　食物过敏是全世界关注的食品安全问题之一,并且患病率呈现逐年递增的趋势。蟹类具有重要的经济价值和营养价值,广受消费者喜爱,但其引起的食物过敏问题也不容忽视。拟穴青蟹（Scylla paramamosain）作为我国东南沿海地区的重要水产资源,其食物过敏病例也日益增多。本研究以拟穴青蟹为实验对象,对青蟹肌肉过敏原磷酸丙糖异构酶（Triosephosphate isomerase,TIM）的晶体结构、交叉反应性及抗原表位进行分析,同时利用定点突变技术改变TIM致敏性,以期获得低免疫结合活性的TIM突变蛋白,为甲壳类水产品分子诊断及免疫治疗奠定基础。本研究首先对拟穴青蟹重组TIM进行体外表达,利用悬滴法获得蛋白质晶体,并对沉淀剂浓度、缓冲溶液pH值等结晶条件进行优化,确定结晶条件为蛋白浓度20 mg/mL、0.1M citric acid（pH 4.6）、22%PEG 6000;进一步通过X射线衍射获得分辨率为1.8?的TIM晶体,其结构呈现二聚体且单体为（β/α）₈筒状;晶体结构分析结果表明,拟穴青蟹TIM具有高度保守的一级、二级结构,且筒状内部β折叠在不同物种间较为保... 

【文章来源】：集美大学福建省

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 食物过敏概况
    1.2 食物过敏原及其抗原表位
    1.3 过敏原的结构生物学及交叉反应
    1.4 甲壳类水产食物过敏原研究进展
    1.5 本研究的目的及意义
第2章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及载体
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 甲壳类水产品过敏患者血清
        2.1.4 主要仪器设备
        2.1.5 主要试剂
        2.1.6 主要溶液配制
    2.2 方法
        2.2.1 野生型TIM的表达与鉴定
        2.2.2 野生型TIM多克隆抗体的制备
        2.2.3 野生型TIM的晶体初筛及条件优化
        2.2.4 野生型TIM的 X射线衍射数据收集及结构解析
        2.2.5 不同物种间TIM结构的比较分析
        2.2.6 TIM构象表位的关键氨基酸定点突变及重组表达
        2.2.7 突变型TIM的理化性质分析
        2.2.8 突变型TIM的免疫结合活性分析
        2.2.9 统计分析
第3章 结果与分析
    3.1 野生型TIM的表达、鉴定及多克隆抗体制备
        3.1.1 野生型TIM的表达与鉴定
        3.1.2 野生型TIM的多克隆抗体制备
    3.2 野生型TIM的晶体培养及结构解析
        3.2.1 野生型TIM的结晶初筛及条件优化
        3.2.2 野生型TIM晶体的衍射数据处理
        3.2.3 野生型TIM晶体的结构解析
        3.2.4 不同物种间TIM结构的比较分析
    3.3 TIM构象表位关键氨基酸的基因定点突变及重组表达
        3.3.1 TIM突变体的构建
        3.3.2 突变型TIM的表达与鉴定
    3.4 突变型TIM的理化性质分析
        3.4.1 突变型TIM的二级结构分析
        3.4.2 突变型TIM的 pH稳定性及热稳定性分析
        3.4.3 突变型TIM的表面静电势分析
    3.5 突变型TIM的免疫结合活性分析
        3.5.1 突变型TIM的 Dot blot及 i ELISA分析
        3.5.2 突变型TIM的嗜碱性粒细胞激活分析
第4章 讨论
    4.1 TIM的结构特征分析
    4.2 TIM的免疫交叉反应分析
    4.3 突变型TIM与野生型TIM的比较分析
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
致谢
参考文献
在学期间科研成果



本文编号：3493791