氯氮平及其代谢物的死后分布及死后弥散研究

发布时间：2017-10-28 11:26

  本文关键词：氯氮平及其代谢物的死后分布及死后弥散研究

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【摘要】：目的 1.建立血液、尿液及组织中氯氮平(Clozapine, CLP)及主要代谢物去甲氯氮平(demethylclozapine, DMCLP)、氯氮平氮氧化物(N-oxidation-clozapine, CLP-NO)的固相萃取/液相色谱-质谱(SPE-LC/MS)的检测方法。 2.研究CLP及其代谢物死后分布及死后弥散规律,为氯氮平中毒死亡案件的法医学鉴定提供实验依据。 方法 1.氯氮平及其代谢物的SPE和LC/MS/MS分析：对检材预处理后,采用OASIS(?)HLB3cc(60mg)固相萃取小柱对检材进行提取净化,采用Agilent(?)XDB-C18液相柱(4.6mm×150mm×3.5um)作为液相色谱柱,进行LC/MS/MS检测。 2.死后分布：新西兰大白兔6只,雄性,隔夜禁食,随机分成两组,用氯氮平分别以LDso剂量(270mg/kg)与4LDso剂量(1080mg/kg)给实验动物(新西兰大白兔)灌胃,待实验动物心跳呼吸等生命体征全部消失后,迅速解剖动物,提取心血、尿、脑、心、肝、脾、肺、’肾等检材,冷冻保存,经固相萃取后,LC/MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)的含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。 3.死后弥散：新西兰大白兔33只,雄性,隔夜禁食,随机分为死后弥散组(15只),温度影响组(6只),剂量影响组(6只)和灌胃时间影响组(6只)。 死后弥散组：将新西兰大白兔固定于兔台上,夹闭气管处死,死后1h以LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,染毒后实验动物置于常温条件下,分别于0.5d,1d,2d,4d,6d各解剖3只实验动物,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,-20℃保存,经固相萃取后,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。 温度影响组：将新西兰大白兔固定在兔台上,夹闭气管处死,死后1h以LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,将染毒后实验动物各三只分别置于-20℃,4℃及常温条件下保存,4d后全部解剖,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,检材于-20℃保存,经固相萃取后,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。 剂量影响组：将新西兰大白兔固定在兔台上,夹闭气管处死,死后1h分别以1/2LD50(135mg/kg)、LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,将染毒后实验动物置于常温条件下,4d后解剖,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,检材于-20℃保存,后经固相萃取,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。 灌胃时间影响组：将新西兰大白兔固定在兔台上,夹闭气管处死,于死后1h、3h、6h分别以LD50(270mg/kg)剂量CLP给实验动物(新西兰大白兔)灌胃染毒,将染毒后实验动物置于常温条件下,4d后解剖,提取脑、心、肺、肝、肾、右下肢、玻璃体液、心血、尿、胆汁,检材于-20℃保存,经固相萃取后,LC-MS/MS定性定量检测其中CLP及其代谢物(DMCLP和CLP-NO)含量,定性检测葡萄糖醛酸氯氮平(CLP-G)。 4.采用SPSS11.5统计软件处理实验数据,结果以x±S表示。 结果 1.氯氮平及其代谢物SPE-LC/MS/MS分析 ①采用Agilent(?)DB-C18(4.6mm×150mm×3.5um)液相柱,前接phenomenex保护柱(DIKMA公司,美国)作为液相色谱柱,目标物出峰最宜；血、尿及组织样品中加入适量2.5moL/L碳酸钠调PH至11时目标物回收率最佳；采用OASIS(?)HLB3cc(60mg)柱固相萃取进行提取,较液液萃取(乙酸乙酯)提取回收率高。 ②液相色谱/质谱检验(LC/MS):使用电喷雾正离子源(+),采用多反应监测MRM扫描方式,MRM监测各组分离子对进行定性,氯氮平的定量离子对(327/192),去甲氯氮平(313/270.2),氯氮平-N-氧化物(343/243.1),葡萄糖醛酸氯氮平(503/327),安定(313/154.1),尿液中CLP、DCLP、CLP-NO的线性检测范围为5或10-1000ng/mL,最低检测浓度分别为5或10ng/mL;血液中CLP、DCLP、CLP-NO的线性检测范围为2或5-1000ng/mL,最低检测浓度为2或5ng/mL;肝中CLP、DCLP、CLP-NO的线性检测范围为50-1000ng/mL,最低检测浓度为50ng/mL。 2.死后分布 LD50组及4LD50组染毒致死家兔体液和组织中均检出CLP、DMCLP和CLP-NO,尿液中均检出CLP-G,其余组织和体液中未检出CLP-G。 LD50灌胃组：CLP含量从高到低分别为：肺肝、肾、脑、脾胆汁、心肌、心血尿、玻璃体液、下肢肌；DMCLP在各脏器的含量从高到低分别为肺、肝肾、脑、脾胆汁、心肌、心血、尿、玻璃体液下肢肌；CLP-NO在各脏器的含量从高到低分别为肺、肝肾、脑、脾胆汁、心肌、心血、尿、玻璃体液、下肢肌。 4LD50灌胃组：CLP含量从高到低分别为：肺、肝肾、脑、脾胆汁、心肌心血、尿、玻璃体液、下肢肌；DMCLP含量从高到低分别为肺、肝肾、脑、脾心肌、胆汁、心血、尿、玻璃体液下肢肌；CLP-NO含量从高到低分别为肺、肝肾、脑、心肌脾、胆汁、心血、玻璃体液、尿下肢肌。 3.死后弥散 死后弥散动物模型中,所有检材中均未检出氯氮平代谢物。 死后弥散组：LD50染毒家兔死后常温保存时,0.5d后心肌、心血、肺、肝、肾均检CLP,1d后脑、下肢肌中也检测出CLP,2d后胆汁也检出CLP,玻璃体及尿液一直未检出CLP。 温度影响组：-20℃组肝、脾、肺中均检出CLP,其余均未检出CLP；4℃组心、肝、脾、肺、肾、脑均检出CLP；常温组除尿、玻璃体液未检出CLP外,其余均检出CLP。 剂量影响组：1/2LD50、LD50、2LD50三种剂量下,尿、下肢肌均未检出CLP,心肌中CLP的浓度随着灌胃药物浓度的增大而增大。 灌胃时间影响组：1h组尿、玻璃体液中未检出CLP;3h组尿、玻璃体液、下肢肌中未检出CLP;6h组尿、玻璃体液、下肢肌、心、肾中未检出CLP,各组其余组织和体液中均检出CLP。 结论 1.本文建立同时测定生物检材中CLP、CLP、DMCLP和CLP-NO定性、定量及CLP-G定性的SPE-LC/MS/MS检测法,回收率高,重现性好,特异性高,灵敏度高,适用于临床中毒的快速检验和法医中毒案件的检验。 2.CLP及其代谢物在染毒致死家兔体内分布不均匀。LD50组及4LD50组染毒致死家兔体液和组织中均检出CLP、DMCLP和CLP-NO,尿液中均检出CLP-G,其余组织和体液中未检出CLP-G。 3.本实验再次证明CLP在家兔体内可发生死后弥散,保存时间、保存温度和灌胃时间可影响其死后弥散,同时发现6d内所有死后染毒家兔体内均未检出CLP的代谢物DMCLPCLP-NO和CLP-G。 4.比较CLP及其代谢物的死后分布和死后弥散结果提示, DMCLP、 CLP-NO、CLP-G可能成为CLP生前服药的标志物,尿中检出CLP-G可能成为CLP中毒(死)案件法医学鉴定中生前服毒和死后染毒鉴别的依据。
【关键词】：氯氮平 去甲氯氮平 氯氮平-N-氧化物 LC-MS/MS 死后分布 死后弥散
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：D919.4
【目录】：

• 目录4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-18
• 第一部分 氯氮平及其代谢物的HPLC/MS/MS检测18-28
• 1 材料与方法18-20
• 2 结果20-28
• 第二部分 氯氮平及其代谢物的死后分布研究28-35
• 1 材料28
• 2 方法28-29
• 3 结果29-35
• 第三部分 氯氮平及其代谢物的弥散研究35-39
• 1 材料35
• 2 方法35-36
• 3 结果36-39
• 讨论39-42
• 小结42-43
• 参考文献43-48
• 综述48-55
• 参考文献52-55
• 中英文对照表55-56
• 个人简介56-57
• 攻读学位期间论文发表情况57-58
• 致谢58

【参考文献】

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1 王琦玮;莫耀南;周海梅;李朴;马锦琦;刘良;;固相微萃取-气相色谱质谱法测定血浆中的氯氮平浓度[J];中国法医学杂志;2007年02期

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本文编号：1108066