束缚应激对挤压伤大鼠肝损害的影响及其内质网应激机制
发布时间：2017-09-08 16:13
本文关键词：束缚应激对挤压伤大鼠肝损害的影响及其内质网应激机制
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【摘要】：目的：在实际检案中经常遇到当事人遭受非致命性机械性损伤后发生MODS甚至死亡的案件，例如打架斗殴、交通事故、虐待以及刑讯逼供等。由于损伤本身不足以致人死亡，因此常常由于死亡原因不能确定或有争议，导致案件久拖不决，给社会造成不良影响。此外，在临床实践中也经常发生非致命伤患者在治疗期间病情逐渐加重或者死亡的情况，医疗纠纷时有发生，医患关系紧张。因此揭示非致命性机械性损伤的死亡机制是危重病医学和法医学亟待解决的问题。 此类损伤对机体的损害主要包括三方面：①局部组织损伤，产生大量活性自由基进而引起脂质过氧化、细胞内钙离子超载及嗜中性粒细胞的浸润并释放大量炎症因子，以及坏死组织吸收、产生代谢产物，导致远隔器官损伤及全身炎症反应等；②损伤本身作为一种躯体应激原，可引起机体应激反应；③当事人在损伤后产生的紧张、疼痛、抑郁等情绪，以及合法权益得不到维护而产生的不良情绪也可作为心理应激原引起机体应激反应。因此，此类损伤对机体造成的损害是由损伤和应激共同参与的。应激时机体的全身反应主要表现为蓝斑-交感-肾上腺髓质系统(Locusceruleus-norepinephrine system, LC/NE)和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex system, HPA)的激活，使血液中儿茶酚胺和糖皮质激素（在大鼠主要为皮质酮）迅速升高，具有重要的代偿防御意义。但应激原过于强烈或持久时，机体的各种反应虽仍具有某些防御适应意义，但其主要作用则转变为导致机体功能障碍、代谢紊乱和组织损伤。目前应激造成组织损伤的机制尚不明确。 大量研究证实，内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)是应激时主要的细胞反应。内质网是细胞合成、加工蛋白质及贮存Ca2+的主要细胞器。应激激素、氧自由基和细胞因子等都可以干扰内质网功能，导致未/错误折叠蛋白堆积，ERS标志蛋白如GRP78等表达增加，激活ERS。ERS虽是细胞防御适应反应的重要组成部分，但过于强烈或持续时间过长的ERS可通过诱导细胞凋亡和炎症反应造成组织、细胞损伤。因此研究ERS对组织器官的损伤作用对于揭示非致命性机械损伤导致死亡的机制具有重要意义。 肝脏具有合成、生物转化及免疫等多种功能，肝功能障碍可出现出血、继发感染、肾功能障碍甚至肝性脑病等临床综合征。肝细胞代谢功能活跃，含有大量的内质网，而内质网对蛋白代谢和应激信号的传导具有十分重要的作用，因此应激发生时肝脏可能是最易受累的器官之一。大量研究表明，ERS可能是多种肝损伤发生的重要因素之一，且本室前期研究证明，束缚应激可加重挤压伤大鼠肝脏损伤，但机制是否与ERS有关尚不清楚。 挤压伤模型是公认的复制广泛性软组织机械性损伤的动物模型，束缚应激是公认的研究心理精神应激的动物模型。因此为模拟实际案情，本实验以建立大鼠挤压伤和束缚应激的复合模型为基础，研究ERS在肝损伤中的作用机制，为揭示非致命性机械性损伤导致死亡的机制提供实验依据。 方法：健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠36只，体重200~220g，于控制条件下适应性喂养一周后，随机分为六组。①正常组：大鼠常规条件喂养，不给予任何刺激，作为空白对照。②禁食水组：大鼠于每天固定时间(08:30㧟16:30)禁食水，其余时间自由进食水，自由活动，连续7天。③束缚应激组：每天将大鼠于固定时间(08:30㧟16:30)放入束缚应激模具内8小时，禁食水，其余时间可自由活动及进食水，连续束缚7天。④挤压组：大鼠用无水乙醚麻醉后，于双后肢上压24kg重物，连续挤压6小时。⑤复合模型组：每天于固定时间(08:30㧟16:30)将大鼠放入束缚应激模具内8小时，连续7天，于次日无水乙醚麻醉后，双后肢上压24kg重物连续挤压6小时。⑥ERS抑制剂组：大鼠在每日束缚应激或挤压前半小时给予10mg/mL4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)1.5mL腹腔注射。正常组、禁食水组和束缚应激组分别于造模结束后即刻取大鼠肝脏组织；挤压组、复合模型组及ERS抑制剂组分别于造模结束后3天取大鼠肝脏组织，一部分经固定制作石蜡切片，一部分经液氮速冻后㧟80℃冰箱保存。石蜡切片进行苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理学改变及应用免疫组织化学染色(IHC)方法观察大鼠肝组织中ERS标志蛋白GRP78和CHOP蛋白表达的变化。㧟80℃冰箱保存的肝组织经匀浆提取蛋白后应用Western印迹法检测大鼠肝组织ERS标志蛋白GRP78和CHOP以及凋亡执行分子Caspase3蛋白表达的变化并应用酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测肝组织炎症因子IL-1的表达量改变。 数据以“均数±标准差(Mean±SD)”表示，用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(least significant difference, LSD)作两两比较，以P0.05为有显著统计学差异。 结果： 1肝脏HE染色结果 正常组肝组织结构清晰，肝细胞大小一致、以中央静脉为中心呈索状整齐排列；禁食水组可见血管周围有少量炎细胞浸润；束缚应激组可见肝细胞轻度水肿和少量炎细胞浸润；挤压伤组可见肝细胞水肿和炎细胞浸润；与挤压伤组相较，复合模型组大鼠肝脏组织损伤更加严重，可见肝索排列紊乱，炎细胞浸润、肝细胞水肿、肝细胞脂肪变性及肝细胞坏死，部分肝细胞发生气球样变；ERS抑制剂组可见肝细胞水肿及炎细胞浸润，但大鼠肝脏组织病理学变化较复合模型组减轻。 2肝组织ERS标志蛋白GRP78和CHOP免疫组织化学染色(IHC)结果 光镜下，免疫阳性细胞胞浆呈棕黄色、细胞核呈淡蓝色；部分阳性细胞发生细胞凋亡的形态学改变：细胞皱缩，细胞核碎裂、溶解。 正常组大鼠肝组织GRP78和CHOP蛋白有少量阳性表达；禁食水组大鼠肝组织GRP78和CHOP蛋白有少量阳性表达，位于细胞浆内，呈棕色。束缚组大鼠肝组织GRP78和CHOP蛋白表达增多。挤压伤组大鼠肝组织GRP78和CHOP蛋白表达进一步增多；与挤压组相比，，复合模型组阳性细胞数目明显增多且阳性表达明显增强；与复合模型组相比，ERS抑制剂组阳性细胞数目减少并且阳性表达减弱。 3肝组织ERS标志蛋白GRP78和CHOP以及凋亡执行分子Caspase3的Western印迹检测结果 正常组和禁食水组GRP78、CHOP和Caspase3蛋白有少量表达；束缚组大鼠肝组织GRP78、CHOP,和Caspase3蛋白表达量增多；挤压伤组大鼠肝组织GRP78、CHOP和Caspase3蛋白表达进一步增多；与挤压组相比复合模型组大鼠肝组织GRP78、CHOPh和Caspase3蛋白表达均明显增多，p＜0.05；ERS抑制剂组，大鼠肝组织GRP78、CHOP和Caspase3蛋白表达量较复合模型组明显降低，p＜0.05。 4肝组织炎症因子IL-1检测结果 正常组和禁食水组炎症因子IL-1有少量表达；束缚组大鼠肝组织IL-1表达增多；挤压伤组大鼠肝组织IL-1表达进一步增多；与挤压伤组相比复合模型组大鼠肝组织IL-1表达明显增多，p＜0.05；ERS抑制剂组大鼠肝组织炎症因子IL-1表达量较复合模型组明显降低，p＜0.05。 结论： 本研究成功建立了大鼠束缚应激和挤压伤及其复合模型，通过检测ERS标志蛋白GRP78、ERS诱导凋亡的关键分子CHOP、凋亡执行者Caspase3以及炎症因子IL-1的表达水平，得出以下结论： 束缚应激可以加重挤压伤所致的大鼠肝脏损伤，其机制与内质网应激诱导的细胞凋亡和炎症反应有关。
【关键词】：应激 内质网应激 肝脏 束缚 挤压 4-苯基丁酸
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：D919.1
【目录】：
- 摘要4-8
- ABSTRACT8-13
- 英文缩写13-15
- 前言15-16
- 材料与方法16-28
- 结果28-31
- 附图31-38
- 附表38-39
- 讨论39-44
- 结论44-45
- 参考文献45-50
- 综述 内质网应激与肝损害50-65
- 参考文献59-65
- 致谢65-66
- 个人简历66
【参考文献】
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本文编号：814999
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