铜离子对小鼠原代肝细胞及氧化应激相关蛋白的毒性效应的研究

发布时间：2017-11-05 17:27

  本文关键词：铜离子对小鼠原代肝细胞及氧化应激相关蛋白的毒性效应的研究

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【摘要】：铜是生物体必需的微量元素之一,对生命活动具有举足轻重的作用。然而,铜作为一种重金属,在能源、电镀、建筑、交通运输、军事武器等行业的应用十分广泛,铜对环境造成的污染问题也越来越严重,其对健康的危害也越来越突出。重金属铜可通过消化道、呼吸道和皮肤等吸收进入体内,经血液循环输送到各个器官,并在肝脏、肾脏、大脑等器官处积累,造成细胞、器官以及机体的氧化损伤。众多疾病的发生与氧化应激效应密切相关。研究表明,铜类污染物可诱发机体氧化应激,使机体产生过量的活性氧,打破机体正常的氧化还原平衡,造成生物大分子、脂类物质、DNA的氧化损伤,进而引起细胞氧化损伤或功能紊乱,诱发疾病等。重金属类污染物的毒性效应往往体现在分子、细胞和动物三个层面上,单一层面的评价不足以全面阐明铜的毒性效应。因此,有必要从多个层次探究铜离子暴露诱发的氧化损伤毒性机理和揭示铜暴露健康损害的微观机制。本文从铜毒性作用与氧化应激效应的相关性入手,以细胞毒理学和分子毒理学为依托,从细胞和分子水平上评价铜暴露诱发细胞氧化损伤的毒性效应、机理以及铜与蛋白质作用机理。本文包括以下五个部分：第一部分：介绍了铜污染诱发的毒性作用、氧化应激效应以及铜诱发的毒性效应与氧化应激的关系。介绍了本研究领域的进展、存在的问题,论文涉及的主要技术方法、论文的研究内容与意义等。第二部分：选取小鼠原代正常肝细胞为研究对象,从群体细胞和单细胞水平评估短期铜暴露诱发的氧化损伤效应。铜暴露后细胞内氧化损伤的突出表现就是细胞内ROS水平升高,MDA含量升高、GSH含量下降、氧化应激酶SOD活性的升高。同时,由于ROS含量水平的升高和氧化防御机制的改变,铜暴露诱发了细胞内DNA的损伤。此外,群体细胞平均分析水平上ROS的产生、GSH的消耗以及DNA的损伤程度在较低浓度(10或50μM)变化并不显著,但是通过单细胞水平分析发现某些细胞内的上述指标已经发生变化,高ROS水平、低GSH含量以及具有明显DNA损伤特征的细胞在低浓度铜染毒组中开始出现,说明单细胞水平上能更灵敏地评价污染物早期的毒性效应,有利于早期诊断、预警技术的建立。第三部分：以氧化应激关键酶过氧化氢酶(CAT)为研究对象,从细胞和分子两个层面上研究了Cu~(2+)对CAT的结构和功能的影响。研究表明,铜暴露诱发的氧化应激效应导致了小鼠原代肝细胞内CAT酶活性的下降；同样,Cu~(2+)可通过与CAT的结合作用抑制了离体的CAT酶的活性。分子水平上的研究结果表明Cu~(2+)可引起CAT荧光猝灭,导致其骨架结构和二级结构的改变。两者可能的结合位置位于活性中心的p-折叠附近,Cu~(2+)与His74(组氨酸)和Ser113(丝氨酸)发生相互作用。过氧化氢酶二级结构的改变和铜离子与His74氨基酸的结合是酶活性发生显著下降的主要原因。第四部分：以氧化应激相关酶溶菌酶(Lysozyme)为研究对象,利用多种光谱学手段、等温滴定量热技术ITC及分子模拟、酶活性测试等方法研究了Cu~(2+)与溶菌酶的相互作用机理。研究表明,Cu2+与溶菌酶结合反应是一个自发地过程,其主要作用力是疏水作用力,298 K时大约有3个结合位点。一定浓度的铜离子会致使溶菌酶发生荧光静态猝灭,改变了色氨酸残基的微环境,使得溶菌酶蛋白质骨架变得疏松、二级结构发生改变。而且基于活性残基谷氨酸(Glu 35)和(天冬氨酸)Asp 52位于铜与溶菌酶的结合部位,铜暴露影响了溶菌酶活性的表达。第五部分：以生物大分子人血清白蛋白(HSA)为研究对象,分子水平上研究了铜离子对HSA结构和功能的影响以及两者相互作用的机理。研究表明,铜离子主要以动态猝灭形式引起人血清白蛋白内源荧光猝灭,铜离子达到一定浓度后,进而会导致其骨架结构和二级结构发生变化；铜离子自发地与人血清白蛋白通过疏水作用力结合,结合位点数大约为1。人血清白蛋白酯酶活性在铜离子浓度达到8×10-5M时受到明显抑制,进而可能影响其功能。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X171.5

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本文编号：1145202