【摘要】：微囊藻毒素(microcystins,MCs)是由蓝藻产生,广泛存在于淡水中具有五肽或者七肽相关结构、具有肝毒性和其他毒性的一类毒素。MCs在鱼类和贝类等产品中富集,通过食物链和饮用水进入人体内。MCs具有多种异构体,微囊藻毒素-LR(MC-LR)是其中毒性最强,分布最广泛的一种,对人类身体健康和食品安全造成了严重的威胁。关于MC-LR的检测方法包括生物检测法,仪器检测法与免疫学检测法等。免疫学检测主要是基于抗原抗体之间的特异性反应原理而建立,其中,ELSIA检测法具备迅速、简便、灵敏并且适合大量样品检测等优点;胶体金免疫层析试纸条具有快速、操作简单、直观等特点适合现场的初步检测,免疫学快速检测方法在MC-LR检测中逐渐被重视。本研究基于抗原抗体之间的特异性反应,制备了检测抗原作为固相包被抗原,并且同时将包被抗原与羧基磁珠偶联制备磁珠探针,利用胶体金标记MC-LR单克隆抗体获得金标探针,分别建立了间接竞争ELSIA(ic-ELSIA)检测方法、基于纳米磁珠的MC-LR间接竞争ELSIA(IMB-ic-ELSIA)检测方法和胶体金免疫层析试纸条检测方法实现水环境中MC-LR的检测。利用“碳二亚胺法”将小分子MC-LR与载体蛋白-牛血清白蛋白(BSA)偶联制备固相包被抗原(MC-LR-BSA),利用检测物中的游离靶标与微孔板中固相抗原竞争特异性单克隆抗体的方式建立间接竞争性ELISA(ic-ESLIA),对ic-ESLIA方法检测的主要条件进行优化,优化之后的主要参数为:检测原包被浓度为2μg/m L,包被时间为4℃,12 h;封闭剂为脱脂奶粉,37℃孵育2 h;单抗最佳稀释倍数为1:30 000,37℃孵育1 h;二抗稀释倍数为1:4 000,37℃孵育1 h;TMB底物显色液37℃孵育10 min。MC-LR的线性回归方程为:y=0.4485x+0.1014,相关系数R2=0.9908,检测方法对MC-LR的检测范围是0.99ng/m L-60.34 ng/m L,IC50=7.74 ng/m L;模拟实际样品分别添加浓度为40 ng/m L、20 ng/m L、10 ng/m L、5 ng/m L的标准品,对应的回收率分别为90.78%、88.90%、87.10%、88.00%,平均回收率为88.70%;分别采集了长春市内南湖水、净月潭水、北湖水、伊通河水和自来水进行检测,未检出MC-LR;检测模拟样品,检测出相应含量的MC-LR。将包被抗原与羧基磁珠偶联制备磁珠探针,作为固相载体,通过抗原竞争的方式在磁场的作用下,建立IMB-ic-ELSIA检测方法,并对主要条件进行优化,优化之后的主要参数为:磁珠探针用量为40μg,单抗最佳稀释倍数为1:8 000,37℃孵育10 min;二抗稀释倍数为1:3 000,37℃孵育20 min;TMB底物显色液37℃孵育8 min。MC-LR的线性回归方程为:y=0.4303x+0.0248,相关系数R2=0.9904,检测方法对MC-LR的检测范围是1.50ng/m L-107.15 ng/m L,IC50=12.59 ng/m L;模拟实际样品添加浓度为100 ng/m L、60 ng/m L、20 ng/m L、5 ng/m L的标准品,检测对应的回收率分别为84.72%、91.38%、82.20%、105.80%,平均回收率为91.02%;分别采集了长春市内南湖水、净月潭水、北湖水、伊通河水和自来水进行检测。未检出MC-LR;检测模拟样品,检测出相应含量的MC-LR。采用经典法柠檬酸钠还原法制备了直径约为20 nm胶体金溶液,与MC-LR单克隆抗体共同孵育制备金标探针,以偶联抗原作为检测线,抗鼠二抗作为质控线,利用待检物中的游离靶标与NC膜上的固相抗原竞争胶体金探针的方式建立胶体金免疫层析试纸条检测方法,,并优化主要反应条件。优化后的主要参数为:100μL的胶体金溶液加入0.9μL 0.2mol/m L K2CO3溶液,加入单抗量为1μg;抗原工作浓度为4 mg/m L;二抗浓度为0.3 mg/m L;抗原固定液为0.01 mol/m L PBS;NC膜采用sartorius 140;试纸条检测限为60 ng/m L。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X832
【参考文献】
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2324665
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