两种邻苯二甲酸酯抗体的制备、酶联免疫分析方法的建立及应用

发布时间：2017-03-19 21:04

  本文关键词：两种邻苯二甲酸酯抗体的制备、酶联免疫分析方法的建立及应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate esters,PAEs)是一种增塑剂,被广泛用于工业生产和食品包装材料中。然而,由于PAEs在生产、使用和废弃处理过程中,很容易解离并进入环境中,可造成PAEs在环境中的普遍残留,从而对环境与人类健康产生不利的影响。为了调查环境中此类污染物的分布状况,评估其潜在的环境危害,有必要建立一种针对环境中痕量PAEs高效可靠的分析方法。而邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)及邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)是环境中被普遍检出的两种典型PAEs。目前,DBP与DEP的检测方法主要集中于气相色谱质谱法(GC-MS)、高效液相色谱质谱法(LC-MS)、液质联用(LC-MS/MS)等仪器方法,这些方法具有准确定量的优势,但是,检测成本高、样品预处理复杂和检测周期长等不足限制了其进一步推广。与此相比,基于抗原/抗体的酶联免疫分析方法(ELISA)则具有高通量、高特异性和简单快速等特点,在环境分析中已经得到了广泛应用。因此本研究合成了两种针对DBP与DEP的半抗原,免疫动物分别得到了相应的抗体。在此基础上,分别建立了DBP与DEP的ELISA分析方法,并将其成功用于实际水体及食品介质中该类塑化剂的分析检测,本研究可为进一步的污染调查和风险评估提供技术支撑。主要研究内容如下:1.本研究成功合成了半抗原—4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(4-DBAP),并以重氮化法制备了免疫原DBAP-BSA,对新西兰大白兔免疫后,得到了DBP的多克隆抗体,其效价为25.6×104,本抗体仅对邻苯二甲酸丁苄酯和邻苯二甲酸二乙酯有交叉反应,其交叉反应率分别是22.5%和1.08%。通过一系列条件优化,建立了DBP残留检测的间接竞争ELISA方法,IC50值为421 ng/mL,线性范围为70~1600 ng/mL,相关系数R2为0.9918,LOD为66.6 ng/mL,加标回收回收率在79.7%~105.4%之间,变异系数在3.25%~10.2%之间。2.本研究成功合成了半抗原—4-氨基邻苯二甲酸二乙酯(4-DEAP),并以戊二醛法制备了免疫原DEAP-BSA,对Balb/C小鼠免疫后,成功制备出DEP单克隆抗体细胞株4G2,其效价为9×104,本抗体仅对邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸单乙酯及邻苯二甲酸丁苄酯有交叉反应,其交叉反应率分别是4.29%、2.03%、0.035%。通过一系列条件优化,建立了DEP残留检测的间接竞争ELISA方法,IC50值为72 ng/mL,线性范围为20~320ng/mL,相关系数R2为0.9916,检测限LOD为11.9 ng/mL,加标回收率在76.3%~103.6%之间,变异系数在2.67%~11.48%之间。3.利用上述建立的方法对镇江地区部分小型浅水河流中水体、底泥以及牛奶、咖啡、白酒等常见食品中的DBP和DEP含量进行了测定,结果表明,在市区河流中均存在DBP与DEP的污染(除玉带河因定期清淤,故水质较好),且污染较为严重,亟需治理。而食品中DBP与DEP的残留分别为:ND~300.8ng/mL和ND~112.3 ng/mL,其中DBP在食品中的分布为:白酒咖啡牛奶。总体表明,所检食品中两种PAEs浓度均低于国家食品安全标准。
【关键词】：邻苯二甲酸二丁酯 邻苯二甲酸二乙酯 抗体 酶联免疫分析方法 环境水体
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X830
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 缩略词12-13
• 第一章 绪论13-29
• 1.1 引言13
• 1.2 邻苯二甲酸酯概述13-17
• 1.2.1 PAEs的理化性质13-15
• 1.2.2 PAEs的危害15
• 1.2.3 PAEs的限量标准15-17
• 1.3 环境及食品中PAEs的污染状况17-19
• 1.3.1 环境水体中PAEs的污染状况17
• 1.3.2 大气中PAEs的污染状况17-18
• 1.3.3 土壤中PAEs的污染状况18-19
• 1.3.4 食品中PAEs的污染状况19
• 1.4 邻苯二甲酸酯的仪器检测方法19-23
• 1.4.1 光谱法19-20
• 1.4.2 色谱法20-23
• 1.5 免疫分析方法23-27
• 1.5.1 免疫分析方法的基本原理23-25
• 1.5.2 放射免疫分析方法25
• 1.5.3 化学发光免疫分析方法25
• 1.5.4 荧光免疫分析方法25-26
• 1.5.5 电化学发光免疫分析方法26
• 1.5.6 酶免疫分析方法26-27
• 1.6 本研究的目的和意义27
• 1.7 研究内容27-29
• 第二章 邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体的制备、酶联免疫分析方法的建立及应用29-59
• 2.1 实验材料29-32
• 2.1.1 试剂和药品29-30
• 2.1.2 仪器与设备30-31
• 2.1.3 溶液配置31
• 2.1.4 实验动物31-32
• 2.2 实验方法32-42
• 2.2.1 透析袋的预处理32
• 2.2.2 DBP半抗原的制备32-33
• 2.2.3 DBP免疫原和包被原的制备33-34
• 2.2.4 动物免疫34-35
• 2.2.5 制备血清35
• 2.2.6 抗血清的筛选35-38
• 2.2.7 间接竞争ELISA方法的优化38-40
• 2.2.8 环境水体及食品样本中DBP的检测40-42
• 2.3 结果与讨论42-58
• 2.3.1 DBP免疫半抗原的鉴定42-44
• 2.3.2 DBP免疫原和包被原的鉴定44-45
• 2.3.3 抗血清的筛选45-46
• 2.3.4 ELISA方法的优化46-54
• 2.3.5 镇江环境水体及食品中DBP的检测54-58
• 2.4 本章小结58-59
• 第三章 邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体的制备、酶联免疫分析方法的建立及应用59-88
• 3.1 实验材料59-61
• 3.1.1 试剂和药品59
• 3.1.2 仪器与设备59-60
• 3.1.3 溶液配置60-61
• 3.1.4 实验动物61
• 3.2 实验方法61-72
• 3.2.1 透析袋的预处理61-62
• 3.2.2 DEP半抗原的制备62-63
• 3.2.3 DEP免疫原和包被原的制备63
• 3.2.4 动物免疫63-64
• 3.2.5 制备血清64
• 3.2.6 抗血清的筛选64-66
• 3.2.7 单克隆抗体的制备66-70
• 3.2.8 间接竞争ELISA方法的优化70-71
• 3.2.9 环境及食品样本中DEP的检测71-72
• 3.3 结果与讨论72-87
• 3.3.1 DEP免疫半抗原的鉴定72-74
• 3.3.2 DEP免疫原和包被原的鉴定74-75
• 3.3.3 抗血清的筛选75
• 3.3.4 单克隆抗体的制备75-76
• 3.3.5 ELISA方法的优化76-84
• 3.3.6 镇江环境水体及食品中DEP的检测84-87
• 3.4 本章小结87-88
• 第四章 结论与展望88-90
• 4.1 结论88-89
• 4.2 展望89-90
• 参考文献90-98
• 致谢98-99
• 硕士期间所发表论文99

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