从分子、细胞水平研究三种类型表面活性剂的毒性效应与机理

发布时间：2020-03-24 08:52

【摘要】：由于具有良好的特性,表面活性剂被广泛应用于个人护理、洗涤产品等各领域。随着相关行业的发展,其产量及用量仍在迅速增长。这些产品在使用后,残留的表面活性剂在环境中聚集,影响地表水及土壤的环境甚至是生态系统的稳定性,同时通过食物链的富集作用甚至是直接接触进入人体,随血液循环系统分布到全身各处。其中,全氟表面活性剂作为一种持久性有机污染物,其在体内造成的潜在毒性及生物积累性,已引起全球广泛关注。表面活性剂进入机体后会诱发一系列的毒性效应,在动物、细胞及分子层面均有报道。但是,目前对于表面活性剂在血液传输过程中造成的毒性作用的报道还较少,其毒性作用的效应和机理,尚未阐明。同时,随着全氟辛烷磺酰基化合物的禁用,对其替代品进入机体后是否会造成明显的毒性,目前尚无定论。为了更好地评价和阐明表面活性剂在血液传输过程中造成的毒性效应与作用机理,本研究从细胞和分子层面上研究了三种不同类型表面活性剂在血液传输过程中造成的毒性效应与作用机理。第一章介绍了环境中表面活性剂的污染现状以及表面活性剂毒性效应的研究进展,概述了氧化应激、氧化损伤及其调控和作用机制。通过文献综述,总结了本领域的研究进展和目前存在尚待解决的科学问题,并针对这些问题设计了本论文的研究方案。第二章以转运蛋白人血清白蛋白(HSA)与牛血红蛋白(BHb)为靶蛋白,从分子层面上研究了不同类型表面活性剂对蛋白结构、功能的影响及机理。(1)以转运蛋白HSA为靶蛋白,从分子层面上研究并比较了阴、阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与HSA的相互作用的效应与机制。结果表明,两种小分子均主要通过静电作用力与HSA结合,并且对HSA的结构及功能造成影响。随着CTAB浓度的增加,HSA的骨架结构变松散,α-螺旋含量从51.6%降低至36.8%,β-折叠含量从7.5%增加至14.9%;SDS浓度的增加未使骨架结构发生明显变化,仅使HSA的α-螺旋含量降低3.2%,β-折叠含量增加2.9%。可以看出,CTAB对HSA结构造成的影响明显强于SDS。随着SDS的加入,HSA的酯酶活性受到明显抑制,严重影响HSA的催化功能;CTAB的加入会使HSA的酯酶活性先升高后下降,高浓度时对HSA酯酶活性的抑制弱F于SDS。结合分子对接的结果,由于SDS与HSA结合在酯酶活性中心区域,与关键氨基酸残基直接发生相互作用,因此抑制了 HSA的酯酶活性。CTAB未与HSA结合在酯酶活性中心区域,在高浓度下对HSA的骨架及二级结构造成的影响间接抑制HSA的酯酶活性。(2)以转运蛋白HSA为靶蛋白,从分子层面上研究并比较了三种不同碳链长度的全氟表面活性剂全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟己烷磺酸(PFHS)及全氟丁烷磺酸(PFBS)与HSA的相互作用的效应与机制。研究结果表明,三种小分子均通过静电力与疏水作用力与HSA结合,其中静电作用力占主导地位。随着三种小分子的加入,对HSA的骨架及二级结构未发生明显变化。随着PFOS浓度的增加,HSA的α-螺旋含量升高1.8%,β-折叠含量降低3.7%;随着PFHS浓度的增加,HSA的α-螺旋含量降低2.5%,β-折叠含量升高1.5%;而PFBS的加入使HSA的二级结构未发生明显变化。分子模拟结果显示,三种小分子均与HSA结合在酯酶活性中心区域,与关键氨基酸残基发生相互作用,阻止底物进入酯酶活性中心,因此抑制了 HSA的酯酶活性。当达到最高浓度时,HSA的酯酶活性分别降低约70%,60%及50%,可以看出,三种小分子对HSA结构及功能的影响随碳链长度的增长而增强。(3)以转运蛋白BHb为靶蛋白,从分子层面研究并比较了全氟表面活性剂PFOS、PFHS及PFBS与BHb的相互作用的效应与机制。结果表明,三种小分子均与BHb通过静电与疏水作用力结合,其中静电作用力占主导地位。随着三种小分子的加入,BHb中色氨酸(Trp)及酪氨酸(Tyr)残基所处的微环境未发生明显变化,但分子模拟的结果表明,PFOS与PFHS与BHb结合在了关键的Trp 37残基附近,造成的影响较未结合在该关键区域的PFBS所造成的影响大,这与BHb荧光光谱的变化情况相一致。随着三种小分子浓度的增加,BHb的骨架结构未发生明显变化,二级结构中α-螺旋含量分别升高3.81%、2.62%与1.90%。PFOS的加入抑制了 BHb结合氧的能力,并引起了高铁血红素的生成,对BHb运输氧的生理功能造成影响。而PFHS与PFBS的加入则未对BHb运输氧的功能造成明显影响。这说明三种小分子对BHb结构及功能的影响随碳链长度的增长而增强。第三章以血细胞为靶细胞,从细胞层面上研究了不同类型表面活性剂在血液传输过程中对红细胞及白细胞产生的毒性效应。(1)以红细胞及白细胞为靶细胞,利用光谱学手段及细胞实验,评价并阐述了不同碳链长度的全氟表面活性剂PFOS、PFHS及PFBS在血液传输过程中对红细胞及白细胞产生的毒性效应。研究结果表明,三种小分子对红细胞的结构并未造成明显影响,但会影响红细胞的正常生理功能。4h暴露下,随着三种小分子的加入,血液总抗氧化能力轻微上升,缓解氧化应激对血液产生的氧化损伤。但当浓度达到最高时,血液的抗氧化系统不足以应对三种小分子引起的氧化应激,过量的活性氧物质(ROS)诱发氧化损伤,造成血液总抗氧化能力降低。24h暴露会影响白细胞活力,导致白细胞凋亡比例增加,造成细胞中ROS含量升高。这些结果说明三种小分子在血液传输的过程中引起了氧化应激并对血细胞产生了毒性,且毒性随着碳链长度的增强而增强。(2)以红细胞及白细胞为靶细胞,利用光谱学手段及细胞实验,评价并阐述了阴、阳离子表面活性剂SDS与CTAB在血液传输过程中对红细胞及白细胞产生的毒性效应。实验结果表明,低浓度下两种小分子的加入会影响红细胞的正常生理功能,当SDS浓度高于1×10-5 mol/L,CTAB浓度高于5×10-6 mol/L时,两种小分子会使红细胞出现明显的溶血现象,破坏红细胞的结构。4h暴露下,随着两种小分子的加入,血液总抗氧化能力及氧化应激相关指标上升,缓解氧化应激对血液产生的氧化损伤。但当浓度达到最高时,血液的抗氧化系统不足以应对两种小分子引起的氧化应激,过量的ROS诱发氧化损伤,造成相关指标降低。而24h的暴露会引发更明显的毒性效应,导致白细胞活力明显下降,白细胞中晚期凋亡细胞及死细胞的比例上升,白细胞中ROS含量明显升高。这些结果说明两种小分子在血液传输的过程中引起了氧化应激并对血细胞产生了毒性,且CTAB表现出的毒性作用强于SDS。第四章结合各部分研究的实验结果,以PFOS作为全氟表面活性剂的代表,比较三种类型表面活性剂对HSA及血细胞产生的毒性效应与机理的异同。从分子层面,低浓度条件下,三种小分子的添加对HSA的骨架及二级结构未造成明显影响,表现出一定的相似性。有所不同的是,在浓度达到1×10-5mol/L后,CTAB会对HSA的骨架及二级结构造成明显影响,而SDS与PFOS对HSA的骨架及二级结构未造成明显影响。由于与HSA结合在酯酶活性中心区域,SDS与PFOS的加入使HSA的酯酶活性受到明显抑制,且随着浓度的升高,SDS对HSA酯酶活性的抑制明显强于PFOS。而CTAB的加入使HSA的酯酶活性先上升后下降,虽未与HSA结合在酯酶活性中心区域,但高浓度下对HSA结构造成的影响间接抑制了 HSA的酯酶活性。三种表面活性剂对HSA结构的影响由强到弱依次为CTAB、SDS、PFOS,但由于结合位置的不同,三种表面活性剂对HSA酯酶活性的影响由强到弱依次为SDS、PFOS、CTAB。从细胞层面,4h低浓度暴露下,三种表面活性剂对红细胞生理功能的影响由强到弱依次为CTAB、SDS、PFOS。在高浓度下,SDS与CTAB会使红细胞出现明显的溶血现象,破坏红细胞的结构,而PFOS未对红细胞的结构造成明显影响。随着三种小分子的加入,SDS与CTAB会造成血液总抗氧化能力及氧化应激相关指标的升高,提高血液对氧化应激的抵抗能力;而PFOS仅使血液的总抗氧化能力轻微上升。但当浓度达到最高时,抗氧化系统不足以应对三种小分子引起的氧化应激,过量的ROS诱发氧化损伤,造成相关指标降低。经24h暴露后,三种小分子对白细胞均表现出一定的毒性作用,造成白细胞凋亡比例增加,白细胞中ROS含量明显升高。有所不同的是,SDS与CTAB会造成白细胞活力的明显下降,且CTAB造成的影响较SDS明显,而PFOS则未对白细胞活力造成明显影响。总的来说,三种表面活性剂对血细胞的毒性由强到弱依次为CTAB、SDS、PFOS。第五章对论文的工作进行了总结,归纳了本研究中的创新点,分析了研究方法的不足,并展望了该领域的发展方向。
【图文】：

荧光光谱,荧光光谱,表面活性剂,荧光峰

扫描过程中使激发与发射波长间保持固定的间隔，当Ａ＞１５ｎｍ时，所得的同步逡逑光谱显示为Ｔｙｒ残基的光谱；而当Ａｋ＝６０ｎｍ时，所得的同步光谱显示为Ｔｒｐ残逡逑基的光谱［１７５〃７６］。图２－２的实验结果表明，随着ＳＤＳ与ＣＴＡＢ浓度的增加，逡逑Ａ人＝６０ｎｍ的同步光谱强度先下降后上升，并且荧光峰出现明显的蓝移，这说明两逡逑种小分子均会对Ｔｒｐ的微环境造成影响，降低Ｔｉｐ残基周围的极性，使Ｔｉｐ所处逡逑的微环境疏水性增加。有所不同的是，ＳＤＳ在２ｘｌ0＿６ｍ0ｌ／Ｌ后荧光峰开始增强，逡逑而ＣＴＡＢ在３ｘｌ0＿５邋ｍ0ｌ／Ｌ后使荧光峰增强，且ＣＴＡＢ使ＨＳＡ荧光猝灭的程度较逡逑ＳＤＳ大，这与荧光光谱的结果基本一致。图２－３的实验结果表明，随着ＳＤＳ浓逡逑度的增加，ＡＸ＝１５ｎｍ的同步光谱强度上升，而ＣＴＡＢ使／Ｕ＝１５ｎｍ的同步光谱强逡逑度先下降，在丨ｘｌＯ＿６ｍ0ｌ／Ｌ后上升，二者均会使ＡＸ＝１５ｎｍ的同步光谱出现明显逡逑的红移

荧光光谱,表面活性剂

显的减色红移现象。在低浓度条件下，ＳＤＳ与ＣＴＡＢ均未对ＨＳＡ的骨架结构造逡逑成明显影响，而在高浓度条件下，，ＣＴＡＢ与ＨＳＡ的相互作用会导致ＨＳＡ的骨架逡逑结构松散，发生去折叠现象。如图２－５，随着ＳＤＳ与ＣＴＡＢ浓度的增加，代表芳逡逑香族氨基酸残基的吸收峰轻微增加，这说明两种小分子对氨基酸残基周围的微环逡逑境造成了影响，与荧光光谱的结果基本一致。逡逑逦／／———逦逦；逦ｒ邋２０３．６逦逦Ｙ／—邋邋逦—逦逡逑＾邋ｊｑ邋．逦？邋Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ邋ＭＡＸ逦１邋ｇ，逦—邋Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ邋ＭＡＸ逦＿邋２０８逡逑．逦—Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ邋ＭＡＸ邋丨逦－２０３．４逦＾逦－邋－邋Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ邋ＭＡＸ＇邋Ｚ逡逑ｉ＼逦．逦／邋＼＾逦－２０３．２邋Ｅ逦１．５－邋＊逦＇逦－２０７邋ｅ逡逑ｖ：：ｉ邋ｉ：逦＇＿？／逡逑Ｖ邋、７逦－２０２．６邋Ｏ）邋｜邋１－３＇逦？／逦0＞逡逑／八＇逦．２０ｉ逡逑－２０２．２邋＾逦＾逦／逦？＇、逦－２０３邋彡逡逑Ａ邋－２０２．０逦，邋１邋．邋ｚ－逦Ｂ邋？＿逡逑ｎ逦Ｄ逦－２０２逡逑１．５８－Ｌ－，邋邋逦
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5

【参考文献】