PM诱导气道炎症和粘液高分泌的分子调控机制研究

发布时间：2020-04-01 11:24

【摘要】：背景空气环境污染问题对人类身体健康产生越来越多的影响,并已经引起世界各国政府和卫生组织关注。根据2002世界卫生报告全世界每年约有800000人因空气污染问题而影响寿命。不得不说,空气污染是我们这个时代最大的杀手之一。空气污染问题增加了人类疾病发生率和死亡率,尤其是呼吸系统疾病。随着工业的快速发展和不断飙升的能源消费,空气污染问题在中国变得越来越严重,并且在经济发达的许多城市的空气污染水平已经超过了 WHO指南规定的上限。在所有空气污染物中,最常见的是颗粒物污染物、二氧化硫和二氧化氮。空气污染物,特别是PM对人体健康造成了相当大的危害。PM是一种广泛存在的空气污染物,是空气中固体颗粒和液滴的混合物。在大城市可吸入肺颗粒物日常浓度,如北京和上海可能达到峰值100-300微克/立方米,远远超过WHO指南规定的上限(10微克/立方米)。流行病学研究表明,PM暴露与肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)等呼吸道疾病的发病率呈正相关。PM且被发现可以刺激促炎性细胞因子的产生,加速凝血,增加内分泌系统的活性,导致神经毒性,引起过敏性致敏,激活适应性免疫反应。然而,介导PM在呼吸系统疾病中的分子机制仍不清楚,具体机制有待进一步明确。第一部分Egr-1在PM引起的气道炎症和粘液高分泌的作用及机制研究背景:PM被认为是引起人类气道疾病的危险因素之一。然而,PM暴露与气道损伤相关的生物学机制尚未完全阐明。目的:本研究的目的是从体内体外实验中探讨早期生长反应基因1(Egr-1)在PM诱导的肺部炎症和黏液的高分泌中的作用。方法:体外应用PM干预HBE细胞建立PM模型。采用Q-PCR和ELISA法检测HBE细胞及其上清中炎症因子和粘液的变化,采用Western Blot法检测HBE细胞中Egr-1、NF-κB(P65 and PP65)、AP-1(P-c-Jun and P-c-Fos)和MUC5AC的蛋白表达。体内模型中,应用PM气道滴注Egr-1敲除小鼠,并检测各组小鼠肺灌洗液中的细胞总数和白细胞分类计数、肺组织病理学HE染色、PAS染色和免疫组化的改变;采用Q-PCR和ELISA检测肺组织和BALF中炎症因子的表达;采用Q-PCR和Western Blot法测定肺组织Egr-1的表达。多环芳烃化合物干预HBE细胞,采用Q-PCR和Western Blot检测Egr-1、炎症和粘液的表达。结果:PM暴露能够诱导HBE细胞和小鼠肺组织中Egr-1的表达。体外实验特异性敲除Egr-1能降低PM诱导的IL-6,IL-8和MUC5AC的表达水平,其机制为Egr-1通过介导NF-κB调控炎症,通过介导AP-1调控粘液高分泌。体内PM暴露动物模型进一步证明了Egr-1敲除老鼠相比野生型小鼠表现了更低气道炎症和粘液表达。PM包含有多种成分,其中多环芳烃化合物同样可以引起Egr-1表达,也同样能促进气道炎症和粘液高分泌,体外实验特异性敲除Egr-1能降低PAH诱导的IL-6,IL-8和MUC5AC的表达水平。结论:据我们所知,我们是首次证明了 Egr-1信号通路参与了 PM引起气道炎症和粘液高分泌。并且可能进一步通过NF-κB调控炎症,通过AP-1调控粘液高分泌。PM中所含的PAHs是PM诱导的肺损伤发病机制中最重要的成分。并再次强调靶向针对Egr-1作为大气颗粒物污染引起气道疾病或引起慢性气道疾病如慢阻肺、哮喘疾病加重的一种新的治疗策略。第二部分坏死性凋亡在PM引起的气道炎症和粘液高分泌的作用及机制研究背景:坏死性凋亡是一种新发现程序性坏死,它参与多种呼吸系统疾病的病理过程。然而,PM是否可以引起气道上皮细胞发生坏死性凋亡,气道上皮细胞发生坏死性凋亡是否在PM诱导的肺部损伤的启到重要作用仍不是十分清楚。目的:本研究的目的是从体内体外实验中探讨气道上皮细胞发生坏死性凋亡在PM诱导的肺部炎症和黏液的高分泌中的作用。方法:PM作用于HBE细胞和小鼠气道后,气道炎症和粘液被评估来测定气道损伤程度。体外应用PM干预HBE细胞建立PM模型。采用Q-PCR检测细胞中IL-6和IL-8炎症因子mRNA变化,Q-PCR检测肺组织中CXCL1、CXCL2、GM-CSF和MUC5AC mRNA的表达;采用ELISA法检测HBE细胞IL-6和IL-8炎症因子蛋白变化,Q-PCR检测BALF中CXCL1、CXCL2、GM-CSF蛋白的表达;采用Western Blot法检测HBE细胞中坏死性凋亡相关蛋白(RIPKI,RIPK3,and Phospho-MLKL)、Egr-1、NF-κB(P65 and PP65)、AP-1(P-c-Jun and P-c-Fos)和MUC5AC的蛋白表达;采用流式细胞仪检测细胞坏死和线粒体活性氧。此外,肺组织病理学HE染色、PAS染色和免疫组化也被评估。结果:我们的研究表明,PM暴露能够诱导HBE和小鼠肺组织中坏死性凋亡的相关蛋白(RIPK1,RIPK3,and Phospho-MLKL)的表达。在HBE细胞中,应用坏死性凋亡抑制剂Nec-1和GSK'872抑制坏死性凋亡发生可以显著降低PM诱导炎性细胞因子,如IL6和IL8和MUC5AC的表达。同样,在PM气道滴注的体内模型中,凋亡抑制剂Nec-1也能够降低小鼠气道炎症和粘液表达。此外,我们发现,在HBE细胞发生坏死性凋亡受线粒体活性氧介导的Egr-1控制,进一步通过介导NF-κB调控炎症,通过介导AP-1调控粘液高分泌。结论:坏死性凋亡在PM引起气道炎症和粘液高分泌中起到重要作用。强调靶向针对气道上皮细胞发生坏死性凋亡作为大气颗粒物污染引起气道疾病或引起慢性气道疾病如慢阻肺、哮喘疾病加重的一种新的治疗策略。
【图文】：

滴注,肺泡灌洗,气道,中粒

逡逑１．３．１．１邋ＢＡＬＦ总细胞及中性粒细胞变化逡逑参照实验室之前造模方法２２，构建颗粒物ＰＭ诱导的气道炎症动物模型。小鼠逡逑分组为野生型对照组（Ｅｇｒ－ｌ＋／＋Ｃｏｎ）、野生型ＰＭ干预组（Ｅｇｒ－１＋／＋ＰＭ）、Ｅｇｒ－１基因逡逑缺陷对照组（Ｅｇｉ＿－ｒＡＣｏｎ）、Ｅｇｒ－１基因缺陷ＰＭ干预组（Ｅｇｒ－ｒ＾ＰＭ）。干预组浓度逡逑为２ｍｇ／ｍｌ的ＰＭ溶液５０ｕｌ连续气道滴注十天，对照组给与等量的生理盐水气道滴注。逡逑最后一天滴注２４小时后处死各组老鼠。实验结果表明ＰＭ组相比对照组，ＢＡＬＦ总逡逑细胞及中性粒细胞有明显升高，且具有统计学意义。同样，，对于Ｅｇｒ－１基因敲除ＰＭ逡逑干预小鼠，相比ＣｏｎｔｒｏｌＰＭ干预组中ＢＡＬＦ细胞总数显著降低，中性粒细胞百分比逡逑也有减少，差异有统计学意义（图１．３．１．１Ａ－Ｂ）。逡逑

炎症因子,中性粒细胞,肺泡灌洗,小鼠

图１．３．１．２气道滴注ＰＭ引起肺泡灌洗中性粒细胞相关的炎症因子明显增多，Ｅｇｒ－ｌ基因敲逡逑除小鼠可以降低ＰＭ诱导中性粒细胞相关的炎症因子表达水平。Ａ、Ｃ、Ｅ、ＧＱ－ＰＣＲ检测逡逑各组炎症因子ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１在ｍＲＮＡ水平的表达。Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＨＥＬＩＳＡ法逡逑检测各组炎症因子ＩＬ－６、ＫＣ、ＭＩＰ－２、ＭＣＰ－１在蛋白水平的表达。结果显示为平均值±标逡逑准误？邋＊ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊ｐ邋＜邋０．０１邋ａｎｄ邋＊＊＊ｐ邋＜邋０．００１．逡逑１．３．１．３小鼠肺部病理变化逡逑小鼠分组为野生型对照俎（Ｅｇｒ－ｌ＋／＋Ｃ0ｎ）、野生型ＰＭ干预组（Ｅｇｒ－１＋／＋ＰＭ）、逡逑Ｅｇｒ－ｌ基因缺陷对照组（Ｅｇｒ－ｒ／＿Ｃｏｎ）、Ｅｇｒ－ｌ基因缺陷ＰＭ干预组（Ｅｇｒ＿ｒＡＰＭ）。逡逑最后一天滴注２４小时后处死各组老鼠。取小鼠左肺组织包埋切片行Ｈ＆Ｅ染色。逡逑显微镜下可见ＰＭ组相比对照组，气道周围有明显的炎症细胞浸润并且炎症细胞逡逑的聚集明显增多，差异有统计学意义。同样，对于Ｅｇｒ－ｌ基因敲除ＰＭ干预小鼠，逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X513;R56

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